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無事に 削除/引用 No.2374-10 - 2010/04/19 (月) 02:35:32 - eris 形質転換の反応時間を延ばしたところ、 複数のコロニーを取得することが出来ました。 また、ligation highを新しいものに交換したことも、 影響したのかもしれません。 原因の究明は出来ていないのですが、 プラスミドは取得できたので、先に進むつもりです。 皆さんありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2374-9 - 2010/04/13 (火) 00:03:35 - XmaI rapさんが仰っているように、サイズが大きくなり、導入効率が下がっている事が考えられます。 エレクトロポレーションで入れてみては。 仮にサイズによらず導入効率が同じと考えた場合、 ３Kのベクターを1ug使った時と同じコロニー数を得ようと思ったら、 ９Kのベクターでは3ug使った時に、同じコロニー数になります。 もちろん、実際は１０Kくらいになると導入効率が下がってくるので、この通りにはいきませんが。 SalIとSmaIですが、 私が行うとすれば、NEBのSalI-HFとXmaIで行います。 （個人的には、SmaIが切れにくい印象を持っています。）

(無題) 削除/引用 No.2374-8 - 2010/04/12 (月) 23:35:32 - やま プラスミドはなにに溶かしていますか？ 水でなくTEとか緩衝液なら 10ulの反応液にプラスミド5ulは多すぎると思います。 1ulぐらいにした方が良いと思います。 一番切れやすい組成になるようになっているバッファー組成が 影響を受けてしまうと思います。 また、15時間切るのはそんなに効果はないと思います。 スター活性の方が怖いと思います。 カタログに長時間酵素反応後の残存活性や完全に切るのに必要な時間は 載っていますので参考にしてみてはいかがでしょうか？ 酵素は0.1ulしか使っていないようですが、ベクターは何ugですか？ 酵素のユニット数はカットするベクターの量に対して十分量ですか？

(無題) 削除/引用 No.2374-6 - 2010/04/12 (月) 20:21:31 - Ｅ ・全体の系をもっと大きくする ・Vectorが大きい場合は、Ligationの際に、通常よりVectorの量を多めに入れる （Vector量があれば、たとえ上手く切断されていなかったにしても、何かしらコロニーは出るはずなので、Vecotor量がそもそも少ないのではないかと思います） ・SalIは切断しにくい酵素なので、TaKaRaのカタログにも、SmaIと同時に切断するときは、1.5×T buffer+BSAのはず（上手くいかないのであれば、面倒でも、bufferを交換したほうがいいと思いますが・・・）

(無題) 削除/引用 No.2374-5 - 2010/04/12 (月) 19:39:50 - 小言幸兵衛 プラスミドの容量ではなくて量を、酵素の容量ではなくてユニット数を、バッファーの符丁だけじゃなくってどこのメーカーのものかを書いた方がよいでしょうね。プラスミドの量と精製度にもよりけりですが、数μgを切断するのなら、慣れるまではもうちょっと大きい反応容量の方が扱いやすく、かつ確実なような気がします。 ところで、 １）制限酵素を0.1μlなんて測り取れるんですか？ ２）pUC119を使ったコントロール実験ではどの位の数のコロニーが出ましたか？ ３）研究指導者がラボに居ないか、質問できないくらい険悪な関係なんですか？

(無題) 削除/引用 No.2374-4 - 2010/04/12 (月) 17:57:58 - eris 返信ありがとうございます。 pREP1は8.9kbの分裂酵母・大腸菌のどちらでも発現可能なベクターです。 pUC119をEcoR�TとHind�Vで切断し、LEU2とnmt1 promoter、nmt1 terminater、ars1を挿入したものみたいです。 MCSはnmt1 promoterとnmt1 terminaterの間にあり、Nde�T、Sal�T、BamH�T、Sma�Tがあります。 配列はCATATGTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGです。 選択マーカーはLEU2(分裂酵母)とamp(大腸菌)です。 プラスミドのカットはSal�TとSma�T同時で、組成はpREP�T5μl、10×T Buffer 1μl、10×BSA 1μl、Sal�T0.1μl、Sma�T0.1μl、滅菌水 2.3μlの計10μlで、30℃で15時間反応させています。 ライゲーション後にDH5αのコンピテントセルに形質転換し、LA培地に塗布しています。 切断については現在別々に切断してみています。 Sma�T(30℃で15時間)→Sal�T(37℃で4時間)の予定です。

(無題) 削除/引用 No.2374-3 - 2010/04/11 (日) 10:50:16 - rap pRep1って、９Ｋくらいある長いベクターじゃなかったですっけ？それだったら、長さが原因かもしれません。それだったら条件を振ればいいですよ。

(無題) 削除/引用 No.2374-2 - 2010/04/11 (日) 09:14:23 - やま pREP1というプラスミドがどういう物なのかわからないのですが、 （分裂酵母のプラスミドですか？同じようにSma�T、Sal�Tサイトに入れてる論文があったので） マルチクローニングサイトの配列はpUC119と同じですか？ Sma�T、Sal�Tが近いとかありませんか？ プラスミドのカットはSma�T、Sal�T同時ですか？別々ですか？ もし、サイトが近いならNEBのカタログなどで上手く切れやすい順番を調べて １つずつ切った方が確実だと思います。

プラスミド作製について 削除/引用 No.2374-1 - 2010/04/11 (日) 00:50:14 - eris 現在、研究室でプラスミドの作製をしています。 pREP1とインサートをSma�T、Sal�Tで切断し、 ライゲーションしているのですが、コロニーが生じません。 同じインサートをもちいてpUC119で行ったところ、 こちらではコロニーが生じ候補となるプラスミドを得ることが出来ました。 pREP1を使っている方など、何かコツのようなものがあれば、 教えていただけませんか？

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