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(無題) 削除/引用 No.2364-6 - 2010/04/10 (土) 20:44:07 - ９ １回でもいいけど、２回すると安心じゃない？ って感じじゃないのかね。

(無題) 削除/引用 No.2364-5 - 2010/04/10 (土) 02:05:33 - TK-1 CsCl bandingでDNAはbandとして濃縮されますが、LPSなどの夾雑物はペレットとして沈殿したり、壁に張り付いたりするもの以外はかなりbroadに広がります。bandの部分だけをaspirateしてもそのようなゴミのコンタミは完全に避けられないので、１回回収してそれを薄めてもう一度回収することによってその辺のゴミのもち込みを少なくしているというように解釈しています。

(無題) 削除/引用 No.2364-4 - 2010/04/09 (金) 15:30:39 - 時代逆行 さっそく、ご回答ありがとうございます。大変参考になります。 カラムももちろん考えたのですが、cDNA poolを含むライブラリなので、できるだけバイアスを減らしたいという理由があり、セシウムを選んでいます。 遠心時間と速度、スケールの関係ですが、同じスケールでもやや低速でO/Nで遠心した方が、高速で短時間遠心するよりきれいになるようです。１回のみの場合は、やや低速でO/N、２回の時は、高速で数時間、その後、１回のみと同じような条件でO/Nのようです。 みなさんが、おっしゃるように、実験者が実験条件で確かめるのが一番のようですね。

(無題) 削除/引用 No.2364-3 - 2010/04/09 (金) 13:56:51 - ~ 昔のボスからは、1回だけではごみが持ち込まれるから、2回やる必要があるといわれました。 ただ、具体的な”ごみ”が何かは聞きませんでした。 私が使っていた細胞ではPEG沈で精製しても生存率や導入効率は悪くなかったので、 予備実験はPEG沈でやっていました。 >また、１回でも良いのでしょうか？ いいか悪いかは実験者が判断するもので、目的を達成すれば"いい"でしょう。 目的を満たすかどうかは、精製したプラスミドを用いた場合の実際の導入効率や細胞の生存率の低下と、 それぞれの目標値、実験者の腕、細胞、プラスミドのロットなどによって異なるのではないでしょうか。 昔計算したときには、塩化セシウム2回回すのであれば、カラム精製してもコスト的に同じでした。 塩化セシウム法でやった方がカラム精製がいいかは検討した方がいいと思います。 ただ、cDNAライブラリーであれば、作っておけば他の目的にも使用できるかもしれませんよね。 可能な範囲で精製はしておいたほうがいいと思いますけど。

(無題) 削除/引用 No.2364-2 - 2010/04/09 (金) 11:41:21 - AP ケースバイケースで一概には言えないと思います。最終的には目的の実験に耐えうる精製度が達成できるか（たとえば、トランスフェクションしたときの生存率が十分か）で判断するしかないのではないでしょうか。 一つ言えるのは、遠心のスケールが絡んでくるだろうということです。十分大きなスケールで（たとえば20-30 mL）の遠心だと、分離が良くなる（分離のキャパシティーが大きいし、不純物との物理的な距離を大きく取ることができる）ことが期待できますが、分離を完了するまで遠心時間がながくかかります。 最近よくある小型の超遠心システム（たとえば3-5 mL）だと、分離にかかる遠心時間は短くてすみますが、大スケールより分離が劣るので２回かける必要があるかもしれません。 おそらく各種プロトコールは単純に遠心時間や回数が違うだけでなく、使用する機種やスケールが条件に入っているのではないでしょうか。ちなみに私の理解では、遠心時間は遠心力とスケールによって決まってくるので、例えば、3 mLのスケールで短時間で回かけるところを、同じスケールでO/Nで遠心しても意味がないように思います。

セシウムを２回おこなう理由 削除/引用 No.2364-1 - 2010/04/09 (金) 11:20:58 - 時代逆行 お世話になります。現在、cDNA libraryを含むプラスミドをセシウム密度勾配遠心を用いて、大量に精製しようとしています。多くのプロトコールが、２回超遠心をかけるようになっているのですが、たまにO/N１回の超遠心もみかけます。 セシウム１回目を数時間行い、O/Nでさらにもう１回まわせば、プラスミドがよりきれいになるのは、以前行っていたので理解できるのですが、O/Nで１回まわすだけでも、それなりにきれいなものがとれる気がします。どなたか、どうして２回まわすプロトコールが、普及しているかお教えください。また、１回でも良いのでしょうか？ cDNAのロスや、その後に行う操作（トランスフェクション）を考えても、そこまで精製度を上げる必要があるのか疑問です。よろしくお願いいたします。

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