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ありがとうございます 削除/引用 No.2360-13 - 2010/04/21 (水) 16:53:19 - 千歳飴 外様さん、応援ありがとうございます。 良い仕事ができるように頑張ります。 実のところ、他の方の誤り(かどうかも判断つきかねています)をどうこうしようという大それたことを考えてるわけではなく、ハウスキーピング遺伝子のPCRによる検出をどうしたものかという疑問を持っただけなのですが、質問の仕方などにもっと気を配ろうと思いました。御助言ありがとうございました。 当初の疑問に戻って、ハウスキーピング遺伝子以外でプライマーの特異性の問題にものすごく困ったことはこれまでなかったのに、ハウスキーピング遺伝子ではよく似た(あるいは部分的に全く同じ)配列の転写産物が存在するために特異的なプライマーの設計が困難で、他の方はどのように対処しているのだろうと興味を持っています。 それから、今のところ私は、プライマーを設計した後に再びPrimerBLASTにかけて(blastnでの検索結果と合わせて)特異性を確認していますが、この方法についても意見を聞いてみたいと思っています。 あまり多くの人の関心を惹かなかったようで、まるで見当はずれのことを考えているのだろうかと気に懸かっています。

(無題) 削除/引用 No.2360-12 - 2010/04/18 (日) 00:13:32 - 外様 異分野の人が、疑問を持って、それまでの常識・慣例の誤りを正してくれることってありますよね。良い仕事ができるように応援します。 いにしえびとの誤りをあまり声高に主張すると、反感を買うことになりかねませんので、それだけは注意しましょうね。

設計できました 削除/引用 No.2360-11 - 2010/04/14 (水) 22:04:21 - 千歳飴 おかげさまで、なんとか4つのハウスキーピング遺伝子のプライマーが設計でｓきました。ありがとうございました。 現在、届いたプライマーについて順次検証中です。最初の1つに関しては、40サイクルまで鋳型非依存的な産物は現れず、鋳型依存的産物に関しても融解曲線分析で綺麗な単一ピークとなり、ゲルで流すと意図した長さのものでした。 当初問題にしていた標的特異性について、試行錯誤した上で次のようなやり方に落ち着きました。 1. PrimerBLASTで3'末端で標的特異性の高いプライマー対を設計させる。 2. 目で見て特に問題の少なそうなプライマーをピックアップする。 3. blastnで、片側ずつプライマーの特異性を見積もる(3'領域が標的非特異的ならボツ)。 4. 条件を緩くしたプライマーブラストで、標的非特異的産物のできる可能性を見積もる(非特異的産物が十分長ければボツにしない)。 beta-Actinやリボソーム蛋白についても、検索した限りでは似た別の転写産物をひっかけないプライマーができました。 それでもなお残る疑問があります。巷で使われているハウスキーピング遺伝子のプライーマはPrimerBLASTやblastnにかけてみると標的特異性が十分にはなさそうなものが結構あるように思われます。標的特異性の高いプライマーを設計する為にどうしたら良いか、あるいはそもそも標的特異性が高い必要があるのか、コメントがあれば是非お願いします。上記1-4の手順について、もっとこうしたら良いなども御助言等もいただけましたら幸いです。

ちょっと考えてみました。 削除/引用 No.2360-10 - 2010/04/13 (火) 00:49:49 - 千歳飴 de Jonge et al.の論文を読み返しています。 この論文で発現量のばらつきが少ないとされた遺伝子は、 偽遺伝子やよく似た配列の遺伝子が多いものがほとんどを 占めています。 検出における特異性が相対的に低く幾つかの転写産物を 平均して発現量を算出したことによってばらつきが少なく なった可能性があるかもしれないと思いました。 (PCRのアニーリングの温度を若干上げたらサンプル間の ばらつきが多くなったということが実際にあります。) 最初に質問した特異性については、この論文で挙げられて いる遺伝子の中でうまく設計できたものがあって、使え そうなものが3つになりました。あと何とかもう1つぐらい 標的特異性が高くプライマーダイマーもできにくいものを 作ることができたらと考えています。 プライマーの設計に関して、何かコメントがありましたら 引き続き宜しく御願いします。

ありがとうございます3 削除/引用 No.2360-9 - 2010/04/12 (月) 00:22:03 - 千歳飴 細胞さん、度々ありがとうございます。 重ねてメッセージをいただけて感謝しています。 細胞さんの研究室で使用されているGAPDHやACTBのプライマーは、 blastnやprimer blastにかけたときにたくさんhitしたりは しないのでしょうか？ ACさん、再びありがとうございます。 ご紹介の論文を読みました。 これまで候補にしてきたもの以外のハウスキーピング遺伝子が 上げられていて参考になります。 RLP27について、blastnとprimer blastにかけてみました。 結論としては、条件によってはプライマーダイマーとは別に 鋳型に依存する副産物が見えてきそうに思えました。これぐらい なら設計の時点ではしょうがなくて、条件を厳しくして副産物が なるべく増えてこないようにするしかないのかなと考えています。 できたらなるべく多くサイクルを回せるプライマーを作りたい のですが、なかなか難しそうです。

(無題) 削除/引用 No.2360-8 - 2010/04/11 (日) 07:12:35 - AC 以下の論文にマウスでの候補遺伝子がリストアップされています。それでも、Blat searchで特異性を確認した方が良いと思いますが。 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17878933

(無題) 削除/引用 No.2360-7 - 2010/04/10 (土) 21:46:37 - 細胞 私どもの研究室ではHK遺伝子としてACTBやGAPDHなどを使用しております。 配列は確かノートを見れば載ってるとは思いますが…

ありがとうございます2 削除/引用 No.2360-6 - 2010/04/10 (土) 20:38:00 - 千歳飴 種はマウスです。 ハウスキーピング遺伝子は特定のものというわけでなく、 事後的に条件によって発現量変化の起こらないものを2つ-3つ みつけたいと考えています。 ご指摘のように、GAPDHやアクチンやリボソーム関係は、 特異的なプライマーを作るのに苦戦しています。

(無題) 削除/引用 No.2360-5 - 2010/04/10 (土) 19:28:16 - AC マウスとかだと、GAPDHやACTBはpseudo genesだらけで、全く使えそうにありません。他にはリボソームファミリー系もよく使われますが、これもBlat searchなどにかけると、あまり特異性がなかったりするんですよねぇ。で、種はなんでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2360-4 - 2010/04/10 (土) 16:50:07 - 細胞 そのtemplateはどんな種でしょうか？ humanですか？ 千歳飴さんが注目しておられる具体的なHK geneの名前を挙げる事はできないのでしょうか？

ありがとうございます。 削除/引用 No.2360-3 - 2010/04/10 (土) 14:35:48 - 千歳飴 細胞さん、ありがとうございます。 うまく動いうていることになっているラボからプライマーをもらって みたのですが、ダイマーができやすかったり、特異性があまり高く なかったりしました。 そんなわけで、自分で設計しようとしているのですが、blast検索 で特異性が問題となりそうなものしか設計出来ず、困っています。

(無題) 削除/引用 No.2360-2 - 2010/04/09 (金) 01:04:16 - 細胞 それはやはり、うまく動いているラボから配列を教えてもらいprimerを購入してみてはと思います。

ハウスキーピング遺伝子のqPCRプライマーの設計 削除/引用 No.2360-1 - 2010/04/09 (金) 00:58:25 - 千歳飴 異分野からバイオ系に移ってきて、苦戦しながら研究している者です。 RT-qPCR法で遺伝子発現解析をするのにも漸く慣れて来ました。 さて、今回、ハウスキーピング遺伝子について、4種類程度のものの 発現量を各条件、各サンプルで比較したいと考えています。 プライマーの設計を始めて気付いたのですが、プライマーの特異性を 確かめるためにブラストにかけると、ハウスキーピング遺伝子の場合 似たようなcDNAがたくさんHitすることが多く設計が大変です。 文献から引いてきたプライマーでqPCRをしてみたところ、ほんの 少しずつ長さの違う複数産物ができて十分な特異性を有していない ことが判明したりしています。 ゲノム上によく似た配列の転写産物が複数あったりする場合、 どのように設計したらよいのでしょうか。

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