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(無題) 削除/引用 No.2355-8 - 2010/04/08 (木) 12:12:45 - ami > インサートに短い断片が含まれていたということでは？ > これが文字通りであれば、電気泳動→切り出しはしていませんよね。 すいません、記載が落ちてました。電気泳動→切り出ししてます。1KB以上のバンドです。 > 使っているHpaIサイトは生えてきたコロニーでも生きているのでしょうか？ 確認してみます。 > ラボでシークエンシングが出来るのであれば、1クローンでも読めば、 たしかに。。読んでみます。 > ライゲーションのネガコンには水かバッファーを入れていますか？ 入れてます。

(無題) 削除/引用 No.2355-7 - 2010/04/08 (木) 09:29:10 - ~ 昔、先輩が作ろうとして、チェックが大変なので断念していました。 使っているHpaIサイトは生えてきたコロニーでも生きているのでしょうか？ ラボでシークエンシングが出来るのであれば、1クローンでも読めば、 ライゲーション部分がどうなっているのか分かると思います。 それによって、ベクター側とインサート側のどちらに問題があるのかも分かるでしょう。 >PrimeSTAR GXLによるPCR productをフェノール抽出後、Taqで72deg,30min反応させてA付加。 これが文字通りであれば、電気泳動→切り出しはしていませんよね。 （それとも低融点アガロース→切り出し→フェノール抽出のことでしょうか？） モル数で圧倒的に多くできた小さなごみ(二本鎖DNA)がライゲーションに持ち込まれれば、 目的の産物が入ったコロニーよりも、ごみがはいったコロニーの方が圧倒的多数出てくるかもしれません。 １クローン読んで、おかしな配列が入っていたら、これが怪しいと思います。 >再度フェノール抽出。 ライゲーションのネガコンには水かバッファーを入れていますか？ 実はフェノールの持込が多くて、ネガコンではライゲーション反応が阻害されていて、 サンプルを入れるとフェノールも希釈されて反応が進んでいるなんてありませんかね。 Tの付加がうまく行っていない場合には、こちらが疑われます。

(無題) 削除/引用 No.2355-6 - 2010/04/08 (木) 09:20:35 - ばいや インサートに短い断片が含まれていたということでは？ インサートの調整をどうやっていて、クローン化後の確認をどうやっているのかわからないのでなんともいえないけど。

(無題) 削除/引用 No.2355-5 - 2010/04/07 (水) 22:00:13 - 細胞 ですが、PCRのテンプレートがplasmidではなく、cDNAならinsertだけではまずコロニーは出ないでしょうね。うーん不思議ですね。 insertがあることで、T-vectorの環状化が起こるってことですね。。

(無題) 削除/引用 No.2355-4 - 2010/04/07 (水) 21:48:14 - ami > その切断酵素の配列はクローニング後にも保存されていることは確認済でしょうか？ 確認してます。 > ちゃんとシングルでもカットされていることに信頼は持てますかね？ 普段ちゃんと切れてる酵素です。けっこうスーパーコイルのできるPlasmidで、シングルカットでスーパーコイルのバンドが消えます。 > PCRのテンプレートはcDNAですか、それともplasmidですか？ cDNAです。 > T-vector無し、insertのみでもコロニーが出たりして。。。 やってみます。ただ、得られるPlasmidのサイズはまさにT-vectorのサイズなのです。いや、どこかでコンタミした可能性はあるか、、 > amiさんなら問題ないとは思いますが… DNAは扱い始めてまだ１ヶ月経たないくらいです。。やばいです。。

(無題) 削除/引用 No.2355-3 - 2010/04/07 (水) 21:41:56 - TK-1 PCRのテンプレートはcDNAですか、それともplasmidですか？ T-vector無し、insertのみでもコロニーが出たりして。。。

(無題) 削除/引用 No.2355-2 - 2010/04/07 (水) 21:35:35 - 細胞 >insertが切り出せない その切断酵素の配列はクローニング後にも保存されていることは確認済でしょうか？ amiさんなら問題ないとは思いますが… >single cutのベクターの長さが変わらない ちゃんとシングルでもカットされていることに信頼は持てますかね？ amiさんなら問題ないとは思いますが…

TベクターへのLigation時に不思議なことがおこる 削除/引用 No.2355-1 - 2010/04/07 (水) 21:22:47 - ami 毎度お世話になっております。 自作のTベクターに、A付加したPCR productをLigationしようとしているのですが、不思議な現象に出会っているので、原因が思いつく方はぜひ教えてください。 [自作のTベクター作成] ベクターをHpaIでBluntに切断したのちフェノール抽出、その後TaqとdTTPで2h反応させてT付加後、再度フェノール抽出。 [PCR productのA付加] PrimeSTAR GXLによるPCR productをフェノール抽出後、Taqで72deg,30min反応させてA付加。 [Ligation] T4 DNA Ligaseを用いて、1h ligation。自作のCompetent cellでTransformation。 Ligationのときに、insertなしとありとで、コロニー数に20倍くらい差がある(5 vs 100)のですが、insertありのほうをピックアップしてきても、ひとつもinsertが入っていません(insertが切り出せない、single cutのベクターの長さが変わらない)。いくつかのinsertを試しましたが、どれも同じ結果でした。 PCR productにA付加するところはうまくいっていると思います(invitrogen TOPO TA cloning kitでクローニングできる)。 なぜ、コロニー数では明らかに差があるのに、insertが入ってない、という事態が起こるんでしょうか。。自作Tベクターはあきらめようと思っていますが、この現象が全く解釈できなくて、、

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