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RT-PCRのネガコン トピック削除
No.2350-TOPIC - 2010/04/07 (水) 08:33:38 - にゃん
ただいまRT-PCRをやっています。

RT reactionなしのネガコンを用意するために、逆転写酵素なしを用意したのですが、なんとPCRでバンドを認めました。しかし、逆転写酵素なし、dNTPなしにするとこのバンドは消えました。

genomic DNAが走らないようにPCR用のprimerはイントロンをはさんであり、genomeではPCRのバンドは認めません。また、cDNA合成の前にDNase処理をしているのでgenomeの持ち越しは関係なさそうです。

どなたか、こんな現象に出会ったことありますか？

そのまま素直に考えると逆転写酵素なしでもcDNAができてしまったということになってしまいますが・・・

そんなことって本当にあるのでしょうか？
　
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すみませんでした。 削除/引用
No.2350-8 - 2010/04/09 (金) 05:45:37 - にゃん
すみませんでした。

ある論文を参考にこの実験を立てたのですが、まさか、そんなところに問題があるとは思わず、質問を簡略化するために、省略しました。
こういうところで相談するの、初めてでして。。。

次回はなさそうですが、今後気をつけます。

(無題) 削除/引用
No.2350-7 - 2010/04/08 (木) 07:41:06 - べつに
別にいいんですけれども、

そういう条件を隠して、こんなことが起こりましたって言われて考える人の身になって
相談した方がいいのではないでしょうか？

後出し情報が、実験上の問題点を示しまくっている気がするのです。

解決 削除/引用
No.2350-6 - 2010/04/08 (木) 07:19:02 - にゃん
新しいdNTPでも同じ結果でした。
しかし、一応、解決しましたのでご報告まで。

今回実はちょっと変わったRT-PCRをやってまして。

普通と違うのは
@RT用のprimer: 23bpくらいのgene spesific primerにmouseにはない23bpのlinkerがついているため、結果として46bpものながいオリゴを使用していました。
APCRのprimer:linkerのsequenceと遺伝子上の配列で作成したprimerを使用しました。
この条件だと酵素なしdNTPありで、PCRのバンドを認めましたが、dNTPなし酵素なしだとPCRのバンドを認めませんでした。

そこで、AのPCR用のprimerを両方とも遺伝子上の配列から作成すると、酵素なしのサンプルでもPCRのバンドを認めなくなりました。

不思議な経験をしましたが、こういうtrickeyな条件でRT-PCRをやる方がおられたら、気をつけてください。結局このlinkerをあきらめて、次のstepに行くことにしました。

ありがとうございました。

返答ありがとうございます。 削除/引用
No.2350-5 - 2010/04/08 (木) 04:51:12 - にゃん
＞あああさん
cDNA合成のときにdNTPを抜くとRT-PCRが走らなくなります。
２−３回RT-PCRのプライマーも変えてやりましたが同じように、酵素なしのみでPCRが走り、酵素dNTPなしでPCRが走らなくなります。


やはり、このdNTPが怪しすぎます。ここにコンタミがおきたのかもしれません。そこで、ほかの人が使用しているdNTPを借りてみることにしました。
今やっています。
うまくいくといいのですが。

＞れれれさん
この遺伝子でベクターは作成していないので、少量で致命的なコンタミはおきにくい状況です。
PCRの感度や増幅回数については、怪しいと思っています。あまりRNAを用意できないサンプルなので50回もまわしています。もしこのせいだとしたら、酵素なしでもdNTPさえあれば少しだけcDNAができる。それを無理やり増やしている。ということになりそうです。
そういうことが本当に起こるのかが、一番知りたかったところです。

(無題) 削除/引用
No.2350-4 - 2010/04/07 (水) 23:10:50 - れれれ
PCRの感度や増幅回数にもよるのかもしれないですが、
検量線をひくためにプラスミドDNAをつかっているとか、
PCRのプロダクトを電気泳動で確認するとか、
そういうことをしている場合、
これらのDNAのコンタミネーションにも
気をつけた方がいいかもしれないです。

(無題) 削除/引用
No.2350-3 - 2010/04/07 (水) 08:59:14 - ああああ
あとは酵素、試薬などをすべて新しいものに変えてみるしか無いと思います。

(無題) 削除/引用
No.2350-2 - 2010/04/07 (水) 08:49:05 - ああああ
コンタミぐらいしか考えられないですね。
テンプレートなしでRT Reaction後にPCRするか、RT ReactionなしでRNAをPCRでもすれば原因が絞れてくるのではないでしょうか？
もう試されていたら、申し訳ありません。

RT-PCRのネガコン 削除/引用
No.2350-1 - 2010/04/07 (水) 08:33:38 - にゃん
ただいまRT-PCRをやっています。

RT reactionなしのネガコンを用意するために、逆転写酵素なしを用意したのですが、なんとPCRでバンドを認めました。しかし、逆転写酵素なし、dNTPなしにするとこのバンドは消えました。

genomic DNAが走らないようにPCR用のprimerはイントロンをはさんであり、genomeではPCRのバンドは認めません。また、cDNA合成の前にDNase処理をしているのでgenomeの持ち越しは関係なさそうです。

どなたか、こんな現象に出会ったことありますか？

そのまま素直に考えると逆転写酵素なしでもcDNAができてしまったということになってしまいますが・・・

そんなことって本当にあるのでしょうか？
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