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(無題) 削除/引用 No.2348-7 - 2010/04/08 (木) 18:11:22 - ザンギ 稀に片方のプライマーだけで、紛らわしいサイズの産物ができてしまうことが ありますので、長さだけだと心配ですね。 片方のプライマーだけでPCRしてみて、何も増えてこなければ大丈夫でしょうか ら確認してみては。

(無題) 削除/引用 No.2348-6 - 2010/04/08 (木) 12:28:44 - pcr ＞中年さん ありがとうございます。試してみます。 ＞ザンギさん 泳動による、長さの確認のみ行っています。 ＞~さん 以前、Extaqで成功したことがあるので、今回もいけるかと思ったのですが。 他の酵素も試してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.2348-5 - 2010/04/07 (水) 07:43:33 - ~ 酵素を替えることでうまくいくこともたまにあります。 PrimeSTARでだめだったのが、Pfu Ultraでうまくいったことがありました。

(無題) 削除/引用 No.2348-4 - 2010/04/06 (火) 20:23:41 - ザンギ 1stの産物が設計通りのものかは確認してあるんでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2348-3 - 2010/04/06 (火) 17:17:54 - 中年 プライマーが本来のサイト以外にアニールしてるみたいですね。1stの産物が十分量あるなら、それを10倍程度増やしてプライマー無しでやってみては？

(無題) 削除/引用 No.2348-2 - 2010/04/06 (火) 16:42:04 - pcr もしかして、Taqを使っているせいで、3'末の付加された一塩基のアデニンが伸長を邪魔してるなんて可能性はありますか？

オーバッラップPCRがうまくいかない 削除/引用 No.2348-1 - 2010/04/06 (火) 15:18:38 - pcr 現在、オーバーラップ伸長PCRに手を焼いており、質問させていただきました。 2kbと0.4kbの断片をfusionさせるべくオーバーラップPCRを試みています。オーバーラップ領域は30bpです。1stの産物をゲル精製し、2ndで用いています。2ndでの条件は、2kb断片を50ngに対し0.4kb断片を10ng、プライマーはそれぞれ100pmol、酵素はExTaq、Total100μlです。94℃:0.5min、55℃:0.5min、72℃:3.5minを30サイクル回しています。 しかし目的の断片が増えず、短いほうの0.4kbの断片が増幅したかのようなバンドばかり得られます。 2ndの際、プライマー無しで5サイクル回した後にプライマーを加える、アニーリング温度を50℃に下げる、アニーリング時間を1minにする、といったことは試してみましたが、いずれも同じ結果でした。 どなたかアドバイス頂けないでしょうか？ よろしくお願い致します。

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