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(無題) 削除/引用 No.2347-10 - 2010/04/14 (水) 23:44:09 - ああああ JM109でいいです。

(無題) 削除/引用 No.2347-9 - 2010/04/14 (水) 23:31:06 - 名無しの初心者 ありがとうございます。 まだ試していないのでやってみます。 少し急いでいるので同時に大腸菌株の購入も考えています。 lacリプレッサーを発現する株というのはタカラバイオのカタログにある『JM109』や『HST02』で大丈夫でしょうか？ よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.2347-8 - 2010/04/14 (水) 23:25:34 - ああああ コロニーPCRでポジティブだったコロニーを再度、プレートに塗り広げても増えませんか？ もし、増えるのであれば、ストリーキングして増やせばいいのでは？

(無題) 削除/引用 No.2347-7 - 2010/04/14 (水) 23:19:57 - 名無しの初心者 ありがとうございます。 コロニーの大きさに違いは見られません。 一度37℃で24時間ほど培養し、増えてきた菌を回収して アルカリプレップで粗精製し泳動したことがありますがDNAのバンドは見られませんでした。 やはり菌株の変更かベクター設計を変えるしかないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2347-6 - 2010/04/14 (水) 23:07:38 - ああああ プレート上では、コロニーPCRでポジティブとネガティブのコロニーの大きさは同じくらいでしょうか？ コロニーPCRでポジティブのコロニーだけ小さいのであれば、菌株を変えた方がいいと思います。 同じくらいの大きさであれば、30度で24時間程度カルチャーすると増えてくると思います。もし、若干でも増えたらアルカリプレップで粗精製後、トランスフォーメーションし直して多目のプレートに播いてコロニーを掻き集めれば、必要な分だけいくらでも得ることができます。

(無題) 削除/引用 No.2347-5 - 2010/04/14 (水) 23:07:06 - 名無しの初心者 すみません、書き方が悪かったですが 28℃で12時間培養後、温度を30℃にあげてさらに８時間培養してます。

(無題) 削除/引用 No.2347-4 - 2010/04/14 (水) 22:32:10 - ami > 28℃で12時間培養し試したところ大腸菌は増殖しませんでした。 短いんじゃないかと、、

(無題) 削除/引用 No.2347-3 - 2010/04/14 (水) 19:28:03 - 名無しの初心者 回答ありがとうございます。 ＞（１）まずは、25〜30度での培養を試してみて下さい。pUCのコピー数を下げることで有害性の緩和が期待できます。ただし、コピー数低下に伴いDNA収量は１０分の１程度になるのでご注意下さい。 28℃で12時間培養し試したところ大腸菌は増殖しませんでした。 30℃で培養したところ、やはりコロニーPCRポジティブ株のみ増殖しませんでした。 そこで２つ目のアドバイスであるコンピテントセルの購入を考えています。 ＞（２）BSのLacプロモータで何かが発現しているのであれば、lacI^qをもつ大腸菌をホストとして使うことで解決できるかもしれません。 このlacリプレッサーを発現する株というのはタカラバイオのカタログにある『JM109』や『HST02』で良いでしょうか？ よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.2347-2 - 2010/04/06 (火) 12:56:32 - 大腸菌 同僚の話にヒントがあります 正常・異常を問わず特定のDNA配列由来のタンパク質が大腸菌内で発現して有害に作用することがあり、結果的に大腸菌が増殖しないことがあります。ただし、その配列を含むＢＡＣは存在するし、プレートでは増殖できるようなので程度問題といえます。 （１）まずは、25〜30度での培養を試してみて下さい。pUCのコピー数を下げることで有害性の緩和が期待できます。ただし、コピー数低下に伴いDNA収量は１０分の１程度になるのでご注意下さい。 （２）BSのLacプロモータで何かが発現しているのであれば、lacI^qをもつ大腸菌をホストとして使うことで解決できるかもしれません。

コンストラクションにおいて大腸菌のカルチャーがうまくいかない 削除/引用 No.2347-1 - 2010/04/06 (火) 11:51:21 - 名無しの初心者 現在Cre-loxPシステムを用いたKOマウス作出のためにtargeting vector作製を行っております。 BACから対象領域をPCR増幅し、一度pBS由来のバックボーンベクターにサプクローニングした後 それぞれをcut&ligationする方針で進めています。 ところが最終段階のligationを行った後コロニーを突いてアンピシリン入りのLB培地2mLでカルチャーすると、コロニーPCRでポジティブだった菌株のみ増幅しませんでした。コロニーPCRでハズレの菌は普通に濁っています。 培養時間は10-11時間程度、コンピテントセルはDH5αです。 コンストラクトはベクターが７kbp、インサートが５kbpです。 同僚の人の話ではコンストラクションの際、特定の配列が組み込まれた場合稀に大腸菌内で増幅できないことがある、と聞きました。 この場合コンピテントセルを別のものに変えれば改善されるのでしょうか？ それともベクターの設計自体を変える必要があるでしょうか？ まったく原因がわからず困っています。どなたか同じような事を経験された方いらっしゃいましたらトラブルシューティングご教示ください。 現在修士課程２年の初心者ですので知識もテクニックも未熟ですがどうかよろしくお願いします。

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