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(無題) 削除/引用 No.2341-20 - 2010/04/06 (火) 07:06:15 - どら 二次元で分けて、分かれなければそのスポットをMSで解析とかってできないんでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2341-19 - 2010/04/05 (月) 14:04:55 - 774 IP-WBでは区別できませんかね？ 万が一同じ複合体に存在するとしても、IP効率は大きな差があるでしょうし。 どちらもrabbit抗体とのことなので、H鎖・L鎖と重ならなければいけるかなと。

(無題) 削除/引用 No.2341-18 - 2010/04/05 (月) 10:43:18 - DC みなさんの意見とは少し違っていますが（amiさんとはかぶるかもしれませんが）、AもしくはBを発現していない培養細胞を用いて（膜タンパクという事なので由来動物種を変えれば問題ないかと）、A/Bを過剰発現させた細胞で抗体を吸収させてバンドが薄くなるかどうかで、抗体のSpecificityはある程度わかるのではないでしょうか。 もちろん、amiさんの仰っているようにE-coliなどからの精製タンパクに抗体を当てれば間違いないですが、タンパク精製となるとまた色々条件検討が増えて時間かかる可能性もあるので・・・

(無題) 削除/引用 No.2341-17 - 2010/04/04 (日) 20:16:26 - あべちゃん 過剰発現したAが邪魔をするようでしたら、タグを付けて泳動度を少しずらせてやるというのはどうでしょうか？ そうすれば、みたいBにかぶらないんじゃないですか？

(無題) 削除/引用 No.2341-16 - 2010/04/04 (日) 18:44:21 - 細胞 >はっきり言って電気泳動についてあんまりちゃんと検討したことないでしょう? >いろいろ検討してごらんなさいな。 >結構わかれるもんだから。 わたしもトピ主と同じ経験があります。２Dもそうですが、細胞から抽出したタンパク質をいくつかの方法で分離して分画化したりと色々していましたが、 結構それだけで時間かかります。 それよりはsiRNAなどでどちらかをKDした時に、その抗体の反応性を調べれば一目瞭然です。そうあとで気づきました。 ２Dで分離しなかった場合の解釈として →１．分離があまいため、それができるまで最適な条件を見つける。 →２．実はAもBもidenticalなものであった １か２かを結論付けることはなかなか難しいでしょう２Dであれば。 そう考えて、私は配列特異的なsiRNAを用いればよいのではとレスしたまでｓです。 気を悪くしてしまってはそれは本意ではありません。すみません。

(無題) 削除/引用 No.2341-15 - 2010/04/04 (日) 17:27:10 - こうじ 分離しなかったときの解釈は、、、？ なんて言っている前にやってみりゃいいんだって。 そんな発言繰り返す時点で はっきり言って電気泳動についてあんまりちゃんと検討したことないでしょう? いろいろ検討してごらんなさいな。 結構わかれるもんだから。

(無題) 削除/引用 No.2341-14 - 2010/04/04 (日) 13:40:22 - nnn siRNAに関しては、すでに細胞さんが書かれてましたね。失礼。

(無題) 削除/引用 No.2341-13 - 2010/04/04 (日) 13:36:39 - nnn 皆さんからいろいろ良い抗体の特異性を確認する方法が出ているので、私も少し。 もし、この膜タンパクAと膜タンパクBが両方とも発現していない培養細胞があるならば、 その細胞に、AとBをそれぞれ単独に発現させてウエスタンをするという方法もあります。 別の方法としては、Bに対するsiRNAを使うとか。 ただし、もしAとBが互いに発現安定化などの影響を及ぼしていたら、 A、Bどちらかをノックダウンするだけでもう片方の発現が減少するかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2341-12 - 2010/04/04 (日) 03:48:03 - み 未だ出てない意見としては、 免疫沈降能のある抗体なら、IP産物を両者の抗体でblotして抗体のクロスの可能性を検討するとか。 そもそも免疫源の配列は相同性あるのでしょうか？ まあ配列が全然異なっても高次構造が似ていて、それを認識している可能性は否定できないかもしれませんが。

(無題) 削除/引用 No.2341-11 - 2010/04/04 (日) 01:33:57 - Kanata >[Re:8] APさんは書きました : > 分子量が同等のタンパク質はあっても、等電点まで同じなタンパク質はそうそうないので、分離できる可能性は大いにありです。二次元電気泳動（あるいはほかの方法）で分離できればそれぞれのスポットの増減を見ればいいわけです。 二次元で分離というのはいい方法だと思います。ただ、Kinaseの類だと分子量もPIも割と近いものが多かったりもするので、抗体がCross Reactivityがあるとちょっときついですが、それでもやる価値は十分ありでは。

(無題) 削除/引用 No.2341-10 - 2010/04/04 (日) 00:24:58 - ami あぁ、大腸菌か何かでそれぞれを発現させて精製してきてもいいかも、大事なところならそれくらいの手間なら。

… 削除/引用 No.2341-9 - 2010/04/03 (土) 23:54:04 - DDD >各種処理をおこなった際にAとBが同じ動きをします。 この各種処理ってどういうものなんでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2341-8 - 2010/04/03 (土) 23:08:23 - AP 「ナンセンス」はひどいな。 分子量が同等のタンパク質はあっても、等電点まで同じなタンパク質はそうそうないので、分離できる可能性は大いにありです。二次元電気泳動（あるいはほかの方法）で分離できればそれぞれのスポットの増減を見ればいいわけです。分離できなければ別の手、別の可能性（たとえばA, Bが抗体反応に交差性があるとか）を考えればいいのであって、問答無用で切り捨てるのは論理の階層性がわかっていないとしか思えません。

(無題) 削除/引用 No.2341-7 - 2010/04/03 (土) 22:53:28 - ＴＳ >この手はナンセンスです。 ナンセンスではないでしょう。十分ありです。 ただ、うまく行かない可能性があるということです。 日常的に二次元をやっているとか、気軽に試せる環境にあれば、うまくいけば解決できます。 siRNAの実験は、もちろんうまくいく可能性が高いものですが、オフターゲット効果など、疑わなければならないこともありますよね。 こうじさんもゲルで分ける方法を提案されていますが、 私も、二次元も含めて、どうにかゲルで分離できる条件を探してみると思います。Native pageとかもあり？

(無題) 削除/引用 No.2341-6 - 2010/04/03 (土) 22:47:37 - 細胞 それもamiさんのと同じで分離しなかった時の解釈は…

(無題) 削除/引用 No.2341-5 - 2010/04/03 (土) 22:39:45 - こうじ まずはSDS-PAGEの濃度や手法を少し変えて２つが分離するか チェックされてはどうでしょうか 均一ゲルまたはグラジエントゲルの アクリルアミド濃度（%Cまではあまり振らないと思いますが） 尿素入りのゲルにしたりとか 分子量低めならTricine-PAGEなどもありますし ２つのタンパクに注目するだけなら結構何とかなると思いますよ

(無題) 削除/引用 No.2341-4 - 2010/04/03 (土) 20:08:45 - 細胞 amiさん >二次元電気泳動とか、ＡとＢが分かれる方法使う この手はナンセンスです。 もし抗A抗体、抗B抗体ともに同じ場所にスポットが出てしまった場合には やはり、疑問が最後まで残り、振り出しに戻ると思います。

(無題) 削除/引用 No.2341-3 - 2010/04/03 (土) 19:34:42 - ami 二次元電気泳動とか、ＡとＢが分かれる方法使う とか。

(無題) 削除/引用 No.2341-2 - 2010/04/03 (土) 18:37:05 - 細胞 まあ特異的抗体を用いているのであれば問題ないでしょう。 構造的にも似通ったタンパクなんでしょうか？ そうでもなけりゃきにする必要ないでしょう。 あえてやるんなら遺伝子AをsiRNAなどでノックダウンした時、抗A抗体ではbandがうすくなるが、抗B抗体ではその濃さは変わらない そしてその逆もやれば問題ないでしょう

ウエスタンの一次抗体は同じ重さの他の蛋白もひろいますか？ 削除/引用 No.2341-1 - 2010/04/03 (土) 18:20:15 - tn western　blottingの一次抗体についての質問です。 現在扱っている培養細胞はAという蛋白が過剰発現しているもので、Aに対する一次抗体ではかなり強くバンドが検出されます。 一方、もうひとつ検出したいと考えているBという蛋白がありますが、これはAと同じkDの蛋白です(膜蛋白である点も同じです) また、どちらも2次抗体はrabbitです。 Bに対する一次抗体を用いてウエスタンをおこなうと予想されうる高さにバンドは描出されるのですが、各種処理をおこなった際にAとBが同じ動きをします。 2社の抗B抗体を用いても同じ結果となりました(いずれも論文でよく使用されているものです)。 同一細胞におけるAとBの発現比較をした論文が過去になく、 抗B抗体でdetectしているのが本当にBの蛋白なのか、Aをひろってきてしまっているのか悩んでいます。 このようにある一次抗体がその近傍の重さの蛋白をひろってしまうことはよくありますか？ また、その際にはどういった手法でB蛋白を検出するのが良いのでしょうか？ 皆さんなら抗B抗体がAの蛋白を描出しているかどうかどのように判断しますか？ 初歩的な質問かと思いますが、どなたか教えてください。

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