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(無題) 削除/引用 No.2340-15 - 2010/04/12 (月) 11:31:24 - Sabu みなさんご丁寧にありがとうございます。 結局、今回のprimerはやめたほうがいいという結論ですね。 わかりました。 ただTaqManよりもまずは新しいprimerにしたら？と言われてしまったので とりあえずは別のデザインでなんとかしてみようと思います。 TaqManをやることになりましたら、また助けて頂くことになるかもしれませんがよろしくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.2340-14 - 2010/04/09 (金) 22:41:10 - nnn >TaqManの場合、同じプライマーの間にプローブを挟むというということ >ではないですよね。念の為。 ちょこさん、フォローありがとうございます。 そうです。今回の場合はPrimerが、目的産物以外も増幅することが分かっているのに、そのPrimerにあわせてTaqManを設定するのはやめたほうがいいです。 書き方が悪くてすみません。 >それからTaqManだと特異性が高いとお題目のように唱える人がいますが、 >検出の特異性は高くてもPCRで副生成物ができにくいという意味では >ないですよね。TaqManは、SYBR Green法と違って副生成物を確認しづらい >方法なのに、増幅効率も確かめずにdelta法で数字を出す人がしばしば >いて、こんなのでいいのかなぁと思うことが多いです。 たしかにTaqManのほうは、Primerの濃度を上げて、多少は非特異的な副生物が出てきてもProbeで特異的なものだけを検出しよう、という方法ですからね。 その点、SYBRのほうはシークエンスかければ簡単に証明できますし。 増幅効率を確かめない人がいるのは衝撃ですね。（私の周りにいないだけ？） その後の実験が無意味なものになりかねないのに。 2^(- delta delta Ct)法は増幅効率が100％とみなされる場合に成立する式ですからね。

(無題) 削除/引用 No.2340-13 - 2010/04/09 (金) 00:08:48 - ちょこ > 別のプライマーペアのデザイン（もしくはTaｑMan）をお勧めします。 TaqManの場合、同じプライマーの間にプローブを挟むというということ ではないですよね。念の為。 それからTaqManだと特異性が高いとお題目のように唱える人がいますが、 検出の特異性は高くてもPCRで副生成物ができにくいという意味では ないですよね。TaqManは、SYBR Green法と違って副生成物を確認しづらい 方法なのに、増幅効率も確かめずにdelta法で数字を出す人がしばしば いて、こんなのでいいのかなぁと思うことが多いです。

(無題) 削除/引用 No.2340-12 - 2010/04/08 (木) 17:57:52 - nnn MXさんが言うように、蛍光プローブ法の方が低コピーでも検出できる可能性は高くなります。 ちゃちゃっとTaqMan probe& primerを買いましょう、と言えば良かったのかもしれませんね。 >X軸にCt値、Y軸に鋳型量をLog10でとっていました。 >傾きから増幅効率を換算する早見表には-3.0から-3.8までしかなかったので書かなかったのですが、この傾きを数式に当てはめて算出すると163.1％となりました。こんな増幅効率まず、あり得ないですよね。 おそらく、逆でしょう（笑）、X軸に鋳型量の底が10のLog、Y軸にCt値ですよね？ Ct = (傾き) x (底が１０のLog(鋳型量)) + b この場合、増幅効率Eは、 E = ( (X軸 Logの底) ^ ( -(1/傾き） ) ) -1 = (10^ ( -(1/-2.83) ) ) -1 = 1.256 125.6%ですので、目的遺伝子以外のものまで増えている可能性が高いです。 この場合、このプライマーペアで（SYBR Greenの系で)リアルタイムPCRをするのはあきらめましょう。 別のプライマーペアのデザイン（もしくはTaｑMan）をお勧めします。 >反応条件はリアルタイムPCRでは2ステップ(95℃：15秒、60℃：1分)ですが、RT-PCRでは3ステップ(95℃：1分、60℃：1分、72℃：2分)です。 SYBR GreenでのリアルタイムPCRですが、基本３ステップの方が良いです。 95度 15秒、アニーリング温度 15秒、72度 （時間は機器による。PCR機器がシグナルを検出するのに必要な時間） また、蛍光プローブ法の場合でも、Probeを自分で設計した場合は３ステップの方が良い時もあります。 また、RT-PCRで伸長2分ですが、そんなにPCR産物が長いのでしょうか？ リアルタイムPCRの場合、機器にもよるのですが、70-150bpsくらいがほどよい長さです。 >>どうも、PCRの条件がこのPrimerにはあってないような気がします。 >とのことですが、条件というのは温度や時間のことでしょうか？ >それとも鋳型量やprimer濃度のことでしょうか？ アニーリング温度と３ステップかどうかということでした。 >書き間違いではなく、高コピーでした。 >発現量が低いのにスタンダードの幅を高コピー側に設定してしまったのでこうなったのかもしれない、と考えておりますがいかがでしょうか？ うーん、なんでしょう（苦笑）非特異的な増幅が増えているか、逆に鋳型の入れすぎで増幅阻害が起きているか。。。 >発現量が低くてなかなか検出できない、というのはその遺伝子に関して一般的に言われていることなのでうまくいかない理由を単純にそう解釈していました。 そういえば、PCRの増幅配列によっては、GCリッチであったり、ヘアピンをとったりする場合も検出にしくいです。（すみません、ど忘れしてました。） ですので、プライマーの設計後は、増幅配列を軽く眺めて見てください。 >ザンギさんの仰っていた意味がよく理解できていないです。 >何を確認すればよろしいのでしょうか？　どなたか解説をよろしくおねがいします。 SNPの可能性を仰っているのだと思います。

(無題) 削除/引用 No.2340-11 - 2010/04/08 (木) 12:09:57 - Sabu 申し訳ありません、大前提を忘れておりました。 初めてなのでいろいろなことがわからず、パニックになってます。 リアルタイムPCRはSYBR Green法を使用しています。 現在、周りにはSYBRを使用している方しかいないので、TaqManは検討していませんでした。もしSYBRでは検出できないことが確実になれば、ボスに相談してみようと思っています。 > X軸とY軸のどちらに、Ct値と相対鋳型量をとっているのでしょうか？ > また相対鋳型量のほうは、対数目盛だと思いますが、Log10でしょうか？ > あと、その数値はあってますよね？ > （-0.283ではなくて・・・） X軸にCt値、Y軸に鋳型量をLog10でとっていました。 もちろん数値は間違っていません。 傾きから増幅効率を換算する早見表には-3.0から-3.8までしかなかったので書かなかったのですが、この傾きを数式に当てはめて算出すると163.1％となりました。こんな増幅効率まず、あり得ないですよね。 > あと「高コピーを除くと」とありますが、 > 低コピー（Ct値の大きい方）の書き間違いでしょうか？ 書き間違いではなく、高コピーでした。 発現量が低いのにスタンダードの幅を高コピー側に設定してしまったのでこうなったのかもしれない、と考えておりますがいかがでしょうか？ > PCRの試薬がリアルタイムPCRの試薬と同じなのでしょうか？ > あと、PCRの反応条件（温度、時間）は同じでしょうか？ 試薬は同じものを使っていません。 反応条件はリアルタイムPCRでは2ステップ(95℃：15秒、60℃：1分)ですが、RT-PCRでは3ステップ(95℃：1分、60℃：1分、72℃：2分)です。 ただバンドが確認できたと書きましたが、正確にはdiffuseできれいなバンドとは言い難かったのですが、一応バンドと認識できるものでした。 発現量が低くてなかなか検出できない、というのはその遺伝子に関して一般的に言われていることなのでうまくいかない理由を単純にそう解釈していました。 ザンギさんの仰っていた意味がよく理解できていないです。 何を確認すればよろしいのでしょうか？　どなたか解説をよろしくおねがいします。 >どうも、PCRの条件がこのPrimerにはあってないような気がします。 とのことですが、条件というのは温度や時間のことでしょうか？ それとも鋳型量やprimer濃度のことでしょうか？ 何から何までわからないことだらけで申し訳ありませんが、もう少し知恵をお貸し下さい。よろしくお願いします。

前提ですが， 削除/引用 No.2340-10 - 2010/04/08 (木) 00:15:58 - MX リアルタイムPCRといってもSYBR Green法なのか，蛍光プローブ法(TaqManなど)なのかが分かりません。ちょっと古いですが以下のような論文もあり，低コピーの遺伝子にはSYBR Green法は向かないということが示されています。すでに蛍光プローブ法で試みられているとすればいらないお節介かもしれませんが，参考まで。 Yin JL, Shackel NA, Zekry A, McGuinness PH, Richards C, Putten KV, McCaughan GW, Eris JM, Bishop GA. 2001. Real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) for measurement of cytokine and growth factor mRNA expression with fluorogenic probes or SYBR Green I. Immunol Cell Biol 79: 213-21

(無題) 削除/引用 No.2340-9 - 2010/04/07 (水) 20:42:28 - nnn （できれば、PCRの増幅効率でお答え頂きたかったのですが、） >傾きが-2.83なのですが、 少し確認ですが、そのグラフは、 X軸とY軸のどちらに、Ct値と相対鋳型量をとっているのでしょうか？ また相対鋳型量のほうは、対数目盛だと思いますが、Log10でしょうか？ あと、その数値はあってますよね？ （-0.283ではなくて・・・） >ハウスキーピングではすべてのポイントが検量線上に乗っているのですが、これが普通ですか？ この事から、Sabuさんの実験手技的な問題は低そうですね。 いいPrimerの組み合わせでは、たいてい検量線上に乗ります。 まぁCt35以降は、ばらつきも大きくなってはきますが。 >目的遺伝子のprimerでは検量線のR2が0.96なのですが、これって低いですよね？ 高コピーを除くと0.98にはなりますが、バラツキが大きくほとんどのポイントが検量線上に乗っていないので、気になっています。 「バラツキが大きくほとんどのポイントが検量線上に乗っていない」 どうも、PCRの条件がこのPrimerにはあってないような気がします。 R2に関しては、人によるんじゃないでしょうか。 私の場合は、R2は0.99は欲しいですが。。。 あと「高コピーを除くと」とありますが、 低コピー（Ct値の大きい方）の書き間違いでしょうか？ >この細胞で今回のprimerを使ってRT-PCRをかけたところ、正しい位置にバンドが確認されました。 と、ありますが、 ザンギさんが言われた、 >その細胞の対象遺伝子の塩基配列でプライマーがワークすることを確認してますか？ >１塩基程度のミスマッチだと遅れて増幅することがあります。 に対しての残念ながら検証にはならないでしょう。 PCRの試薬がリアルタイムPCRの試薬と同じなのでしょうか？ あと、PCRの反応条件（温度、時間）は同じでしょうか？ ある意味、半定量RT-PCRでバンドが出るならば、 一番初めに書かれていた、 >発現量が低いためなかなか検出できません。 とはならない様な気がします。

(無題) 削除/引用 No.2340-8 - 2010/04/07 (水) 12:20:03 - Sabu みなさんありがとうございます。 transplantさん RNAの質ですが、確認してみましたが問題ありませんでした。 RT反応に入れるRNAは使用しているキットの最大量2ugを使用しています。 nnnさん ハウスキーピングのCt値は16程度です。 目的遺伝子のprimerでは検量線のR2が0.96なのですが、これって低いですよね？ 高コピーを除くと0.98にはなりますが、バラツキが大きくほとんどのポイントが検量線上に乗っていないので、気になっています。 ハウスキーピングではすべてのポイントが検量線上に乗っているのですが、これが普通ですか？ さらに傾きが-2.83なのですが、やはりprimerが悪いのでしょうか？ ザンギさん この細胞で今回のprimerを使ってRT-PCRをかけたところ、正しい位置にバンドが確認されました。 これで答えになってますか？

(無題) 削除/引用 No.2340-7 - 2010/04/06 (火) 13:09:44 - ザンギ その細胞の対象遺伝子の塩基配列でプライマーがワークすることを確認してますか？ １塩基程度のミスマッチだと遅れて増幅することがあります。

(無題) 削除/引用 No.2340-6 - 2010/04/06 (火) 10:40:55 - 通りすがりです 私は経験はないのですが、発現量の低い遺伝子は希釈するとチューブなどに吸着されてしまい正確な検出が困難になると聞いたことがあります。 タカラのEASY Dilutionのカタログにそんな話が載っていました。 あ、でもEASY Dilutionは主に検量線作成時の話ですかね。

(無題) 削除/引用 No.2340-5 - 2010/04/05 (月) 22:40:01 - nnn >ハウスキーピングや他の遺伝子ではリアルタイムPCRは検出できています。 との事ですので、RTのステップまでは一応いいのかな。 ちなみに、Ct値はハウスキーピングジーンで、おおよそ15-20くらいでしょうか？ （例外として18SrRNAの場合、5くらいでしょうか。） （もちろん、このCt値は、 選んだハウスキーピングジーンの発現量によっても、 PCRの試薬によっても、 PCR機器によっても 異なるので、一概に比較が出来ないのは分かってますが） >発現量の多い臓器では検出できているので、primerに問題はないと思うのですが...。 そのPrimerを用いたリアルタイムPCRの増幅効率は？ あと、増幅効率を確かめた時の検量線から得られる、Ct値のおおよその信頼範囲は？ もし使っているPrimerが、増幅効率も良く、低コピーでもきちんと検出できるのであれば、 単に発現が低いという考察になってしまうのですが・・・ Primerが悪いのであれば、デザインをやり直せばいいでしょうし。

抽出量じゃなくって 削除/引用 No.2340-4 - 2010/04/05 (月) 11:17:33 - transplant 逆転写反応20μlの系でRNA量を1μg→3μgにするとか。 rocheの逆転写キットはRNA5μgまで可能やったはず。 でもあんまり濃くしすぎると逆転写反応、PCR共に阻害がかかりますし適当に加減する必要がありますが。 また、たろうさんも仰っていますがRNAの質は大事ですね。 分光光度計で見たとき、綺麗な曲線になってますか？ 電気泳動したとき、バンドがスメアになってませんか？ RNAの質が良くないと、逆転写にも阻害がかかります。

(無題) 削除/引用 No.2340-3 - 2010/04/05 (月) 09:12:58 - Sabu たろうさんありがとうございます。 RNAはキットで抽出しているので、問題はないと思っていました。 ハウスキーピングや他の遺伝子ではリアルタイムPCRは検出できています。 ディッシュを大きくするというのは、抽出するRNA量を増やすということでしょうか？ RNA量が増えてもRTに使用する量には限界があるように思うのですが。 申し訳ありません、詳しく教えて頂けますか？

培養細胞なら 削除/引用 No.2340-2 - 2010/04/02 (金) 23:11:05 - たろう レアなターゲットでも難易度は低いように思います。 ディッシュを大きいのにしたら良いのではないでしょうか。 それか、きちんとRNAが取れていないだけのような気もします。 RNAの品質チェックや、他の遺伝子のmRNAが検出出来るか、 確かめていますか？

発現量の少ないサンプルでのリアルタイムPCR 削除/引用 No.2340-1 - 2010/04/02 (金) 18:34:50 - Sabu 今回、初めてリアルタイムPCRを使って実験しています。 培養細胞での発現を比較したいのですが、発現量が低いためなかなか検出できません。 発現量の多い臓器では検出できているので、primerに問題はないと思うのですが...。 使用している培養細胞で発現することはわかっていますし、薬剤を添加して発現が増加すると言われているのですが、薬剤を添加したサンプルでも検出できませんでした。 逆転写キットによっても左右されると聞いたので、いくつか試してみたのですが結果は思わしくありませんでした。 リアルタイムPCRにかけるvolumeを増やしたところ、多少の改善は見られましたが、他にいい方法はないでしょうか？ 初めてなのでどうすればいいのかわかりません。 どなたか知恵を貸していただけないでしょうか？

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