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(無題) 削除/引用 No.233-9 - 2009/03/27 (金) 16:10:40 - あべちゃん >[Re:8] atsさんは書きました : > >[Re:7] あべちゃんさんは書きました : > > がしかし、SDSを含むバッファーを入れているため、ゲノムのせいで粘性が高くて、ちょっと扱いにくいというのが正直あります。トピックの趣旨とは逸れますが、このあたりも、将来的に多検体を扱うときに問題になりそうですが、何かいい手はないでしょうかね。 > > benzonaseはSDS存在下でも働きますけど。かなり希釈できるので、タンパク定量には影響しないと思います。 atsさん、 ありがとうございます。 benzonase、昔、DNA結合タンパク質がゲルに入らないという問題が発生したときにお世話になりました。 すっかり、忘れていました。 助かります。

benzonase 削除/引用 No.233-8 - 2009/03/27 (金) 00:13:20 - ats >[Re:7] あべちゃんさんは書きました : > がしかし、SDSを含むバッファーを入れているため、ゲノムのせいで粘性が高くて、ちょっと扱いにくいというのが正直あります。トピックの趣旨とは逸れますが、このあたりも、将来的に多検体を扱うときに問題になりそうですが、何かいい手はないでしょうかね。 benzonaseはSDS存在下でも働きますけど。かなり希釈できるので、タンパク定量には影響しないと思います。

(無題) 削除/引用 No.233-7 - 2009/03/26 (木) 16:25:39 - あべちゃん >[Re:6] 名無しさんは書きました : > 細胞質成分を除いたあとのものというと、核や細胞骨格などが主なものと推察します。これらは塩濃度を高くしたり、強いデタージェントを入れたり、ばあいによってはSDS bufferなど使わないと、通常のマイルドなbufferではそれらの蛋白質は容易には可溶化できないような気がします。その辺はOKでしょうか。 名無しさん、 サジェッションありがとうございます。 現在BCAアッセイで試行錯誤しておりますが、このBCA法はディタージェントの影響を受けにくく、SDSを含んだ溶解バッファーでも利用可能なので選択しました。 溶解はしていると思います。 がしかし、SDSを含むバッファーを入れているため、ゲノムのせいで粘性が高くて、ちょっと扱いにくいというのが正直あります。トピックの趣旨とは逸れますが、このあたりも、将来的に多検体を扱うときに問題になりそうですが、何かいい手はないでしょうかね。 今のところは、粘性は無視してそのままBCAアッセイへと持って行ってますが・・・

(無題) 削除/引用 No.233-6 - 2009/03/26 (木) 10:13:54 - 名無し 細胞質成分を除いたあとのものというと、核や細胞骨格などが主なものと推察します。これらは塩濃度を高くしたり、強いデタージェントを入れたり、ばあいによってはSDS bufferなど使わないと、通常のマイルドなbufferではそれらの蛋白質は容易には可溶化できないような気がします。その辺はOKでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.233-5 - 2009/03/26 (木) 04:48:45 - あべちゃん 名無しさん、 説明不足でした。すみません。細胞膜に穴を開け、細胞質成分を除去したサンプルのタンパク質を定量しようとすると、結構厳しいんです。 Aさん、 ありがとうございます。microBCAなるもの、知りませんでした。ワンオーダー感度が上がればよいのになぁと思っていたので、かなり助かります。 自己レスで恐縮ですが、こんな表がありました。 http://catalog.takara-bio.co.jp/product/basic_info.asp?unitid=U100005064 ここにもmicroBCAの感度が優れていることが示されていますね。 atsさん、 いつも、色々とアドバイスをありがとうございます。僕も最終的には蛍光試薬系かなぁと思っていました。が、今確立中のアッセイ法のメリットは簡便性にあると考えており、また、ハイスループットにも応用できると企んでいたので、できれば避けたい方法だったんです。

(無題) 削除/引用 No.233-4 - 2009/03/25 (水) 20:17:30 - ats 高価でもよいなら、蛍光色素を使う方法が市販されています。 http://www.invitrogen.co.jp/catalogue/molecular_probes/proteomics/proteomics_index.html

(無題) 削除/引用 No.233-3 - 2009/03/25 (水) 18:45:34 - A >Pierce BCA assay kitでは、結構厳しいです。 PierceにはmicroBCA assay kitもありますがこちらも試されましたか？

(無題) 削除/引用 No.233-2 - 2009/03/25 (水) 16:15:41 - 名無し 細胞を溶かすbufferの量が過ぎるために、蛋白質濃度が薄まっているということはないでしょうか。液量を減らせば蛋白質濃度は高くなり一般的な方法で測定できるでしょう。

タンパク定量の感度 削除/引用 No.233-1 - 2009/03/25 (水) 14:36:26 - あべちゃん 培養細胞の全抽出液の蛋白質を定量しています。 いろいろなProtein assay kitが販売されていますが、検出感度の高いものを探しています。 具体的には、96well plateに5,000 cells/wellで継代後、o/nで培養します。 その翌日にその細胞の蛋白質量を定量したいと考えています。 Pierce BCA assay kitでは、結構厳しいです。 BioRad protein assay DC kitならば、少しましです。 できればもう少し感度の良い定量法があると、ある実験においてもう少し精度の高い結果を得られるので、もしご存じであればお教え願えますでしょうか？ よろしくお願いします。

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