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(無題) 削除/引用 No.2326-5 - 2010/04/02 (金) 15:19:32 - 中年 パルスフィールドに使えるようなアガロースだと、0.3%程度でも固まると思います。低温室でしっかり固めて、泳動も低温でゆっくり（ミニゲルで20V位？）泳動すると分かれませんか？

(無題) 削除/引用 No.2326-4 - 2010/04/02 (金) 14:57:18 - ATG 　アドバイスありがとうございます。今回用いているＢＡＣから切り出すＤＮＡ断片と申しますのは、すでに特定の配列をrecombinationによって組み替えたもので、その領域を含む配列を回収しようとしております。 　とりあえずは切り出した後に再び違う制限酵素を用いてＤＮＡを切断し、トランスジーンとして受精卵にinjectionしようと考えております。以前も同じような方法でやっていたのですが、今回はうまい手が見つからずにおります。 　＞- ~様 　コメントありがとうございます。 　回収するＤＮＡ断片の最終目的はトランスジーンとして使用することです（BAC transgenic mouseを作ろうと考えております）。できるだけ精度を上げたいというところが正直なところです。 　30kbの断片をもつ領域は特殊な配列が多く、availableな酵素がありません（キレるような酵素は目的の断片まで切れてしまうので…。）参考文献をありがとうございます。一度眼を通してみようと思います。 　＞TK-1様 　コメントありがとうございます。 　質問が分かりにくくてすみませんでした。今回はligationに用いるのではなく、transgeneとして使用するつもりです。 　やはりパルスフィールド以外は難しいということでしょうか。 　ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2326-3 - 2010/04/02 (金) 01:51:50 - TK-1 150kbのバンドを切り出して精製、ligationするのはかなり難しいと思います。どうしてもgelで分けたければpulse fieldを使わないと無理じゃないでしょうか。 もう既にBACに入っているのであれば、recombineeringでやるのが現実的で確実かと思います。

(無題) 削除/引用 No.2326-2 - 2010/04/01 (木) 19:20:52 - ~ 回収後の150kbで何をしたいのでしょうか？ 何をしたいのかによって、何で対応できるかは変わってくるでしょう。 まずは、その150kbを切らず、30kbくらいのいらない断片をさらに切る制限酵素を探してはいかがでしょうか？ いらない断片の末端の形状が合わなければ、 サブクローニング等であれば、持ち込んでもそれほど問題にならないのでは？ アブストも読めないのですが、 http://ci.nii.ac.jp/naid/110002921972/ の方法は使えませんか？

高分子量ＤＮＡ断片の分画方法 削除/引用 No.2326-1 - 2010/04/01 (木) 18:22:07 - ATG 　いつも参考にさせていただいております。基礎的なことかもしれませんが、質問させてください。 　マウスゲノムの入っているBACクローンを制限酵素処理し、目的の配列を持ったＤＮＡ断片をアガロース電気泳動によって回収しようと思っております。しかし、この目的のＤＮＡ断片のバンドは、同時に出てくるほかのバンドとかぶってしまい、単離ができずにいます。目的のバンドは150kbほどで、ほかのバンドは30kbほどなので、0.5%アガロースなら分離できるだろうと思っていたのですが、全く分離してくれません。 　予算の都合上や物理的な問題からパルスフィールド電気泳動をすぐ行うことはできません。可能であれば、なんとかアガロースゲル電気泳動、または簡単に手に入る試薬、方法などで間に合わせたいと思っております。 　何卒、皆様のお知恵をお貸しください。 　よろしくお願いいたします。

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