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経過報告。 削除/引用 No.2321-19 - 2010/04/18 (日) 03:11:49 - 小栗 PEGによる濃縮を試しましたが、かなりいいですね。ありがとうございます。 クローンテックのパッケージミックスと、現在使っている方法をpLent7.3 (delta GFP)で比べましたがあまり違いがありませんでした。Package plasmidsを単離できるかと試しましたが、インビトロジェンのものと違ってかなり難しそうなので諦めました。 10%FBS+DMEMと5%FBS+OPTIMEMではあまり違いがないようですが、細胞の状態は前者がいいし、PEGで濃縮すればFBSなしの細胞にも使えるので前者にしました。 先日、総合したプロトコールでpLenti7.3(delta GFP)にEGFPを入れたヴェクターでlentivirus（１０ml の培養液) を作り２０倍濃縮した後、6-well　plateで培養しているヒト血管内皮とkeratinocyteに感染させてみましたが、10 ul でほぼ全細胞が1-2日でexpressしていました。Adenoに比べればまだ弱いんですが、実用上ほぼ問題ないぐらいまでいったと思います。 ただ、Mouse　３T３L１では発現が遅い（４日はかかる）ですね。なぜでしょうかね。プロモーターの問題かなあ。

MAX-PEI 削除/引用 No.2321-18 - 2010/04/05 (月) 10:06:47 - 小栗 示された論文は知りませんでしたので参考になります。ありがとうございました。 ちなみに私は次のようにして使っています。 Polyethyleneimine "MAX"(Polysciences)を0.323g／Lの濃度でDDH2Oに溶かし、vacum glass tube に0.22 um fiter sterizationして４Cで保存します。 TransfectionはPlasmid DNAをPBS 100 ul- 500 ul (plateのサイズによります）で希釈した後１ugのDNAについて８ulの上記PEI液を入れてvortex（vortexはするなというのが普通ですがPEIでは違いがないようです）。10分後に適量をculture plateの壁に垂らすようにして２９３T細胞に加えます（Dropすると往々にして細胞が剥がれる）。ゆっくりplateを動かして撹拌した後、次の日の朝にfresh mediaに交換。

すみません。。。 削除/引用 No.2321-17 - 2010/04/05 (月) 09:15:53 - あああ 過去のトピックを検索したら、見つかりました。 http://cshprotocols.cshlp.org/cgi/content/full/protocols;2008/4/pdb.prot4978 聞く前に、検索しろって感じですよね。。。。 以後気をつけます。

MAX-PEI 削除/引用 No.2321-16 - 2010/04/05 (月) 09:10:23 - あああ 普段、Ca-P法でtransfectionしているのですが（安価なので）、インサートの長さによって、効率がだいぶ違うようです。 同じ物なら、常に同じくらいの効率で作成できるのですが、、、、、。 小栗さんの使用されているMAX-PEIと言うのは、初めて聞きました。 試薬の作成方法や使用法など、詳しく教えていただければ幸いです。

PEG濃縮法。 削除/引用 No.2321-15 - 2010/04/02 (金) 10:52:56 - 小栗 ありがとうございました。 大変参考になります。今度試してます。

(無題) 削除/引用 No.2321-14 - 2010/04/02 (金) 10:37:32 - あべちゃん http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech3/biotechforum.cgi?mode=view;Code=2275 参考になるかと思います。 レトロウイルスについて述べていますが、レンチでも同じです。

PEGによる濃縮。 削除/引用 No.2321-13 - 2010/04/02 (金) 07:09:28 - 小栗 必要に応じて、Poly-L-lysineによる高速遠心での濃縮10,000 xg 90minを行ってきましたが、PEGでは1500xg 3０min で済むらしいですね。参考になりました。PEG8000 位でいいのかな。もう少し情報がないと自作しにくいですね。

Nature Protocol 削除/引用 No.2321-12 - 2010/04/02 (金) 07:01:31 - 小栗 貴重な情報ありがとうございます。 読むといくつかのポイントが見えてくるんですが、一つはpHの問題。DMEMで３−５％のCO2ではbuffer能がかなり落ちると思います（最初はアルカリでもすぐ酸性に傾く）。フォーラムの他のトピで書きましたが、DMEMはCO2が７−９％くらいのもとでbuffer能が出るように作られています。 血清のロットの問題ですが、Cal-Pによるtransfectionが血清によってかなり変わるようですね。TransfectionについてはHEPES, BES, Cal-Pで最初検討しましたが、いい時と悪い時のヴァリアビリティーがありすぎて、Cal-Pは諦めました。AAV の作成に使われるMAX-PEIを現在使用しています。Transfection rateはいつもほぼ９０％以上、antibiotics, serumの有無に関係しませんし、なにより恐ろしく安いのです。

濃縮の代替として 削除/引用 No.2321-11 - 2010/04/02 (金) 06:51:01 - はまじ 既にご存じの可能性が高いと思いますが、ご参考まで。 マグネットを使用したレンチウイルスの感染効率の改善は、私が試した限りでは効果的でした。Sigma AldrichのExpressMagというシステムを用いて良好な結果を得ております。とはいっても、効率増加はGFP発現カセットを持つレンチウイルスで検討して、およそ3-5倍程度でしょうか・・・。十倍という事にはならないですね。 あとは、PEGを利用したウイルスの濃縮でしたら、超遠心よりも気楽に出来ると思いますがどうでしょうか？こちらは試したことはありませんがSystemBioscienceで既製品が販売されております。自分で作る方が安上がりですが。 http://www.systembio.com/index.php?id=lentiviral-technology_delivery-systems_peg-it&q=pegit

(無題) 削除/引用 No.2321-10 - 2010/04/01 (木) 17:07:32 - あああ http://www.natureprotocols.com/2007/02/14/production_of_neuronpreferenti.php 先ほどの論文と同じ著者によるものですが、血清のロット差について、書かれていますので、参考まで・・・。

uropean Journal of Neuroscience, Vol. 24, pp. 371ｨC380, 2006 削除/引用 No.2321-9 - 2010/04/01 (木) 12:35:06 - 小栗 この論文の抄録を読みました。adenovirusもそうですが、作成時のmediumのｐHはかなり重要と思います。OPTI-MEMでは５％CO2でbicarbonate solutionをtransfectionの翌日に加えて４８時間でcollectしています。いまoptimizationしている系はDMEMを使って９％CO2でtransfectionの翌日にMedium交換して３６時間ほどでcollect.　DMEMはこのくらいの時間なら９％CO2でbuffer力が十分あるようです。

(無題) 削除/引用 No.2321-8 - 2010/04/01 (木) 12:22:04 - ~ > RetroNectin Reagent can be used to greatly improve transduction efficiencyと書いてあります。詳しくはマニュアルを参照してください。私には本当かどうかは判断できませんが。 コメントありがとうございます。やっぱり自分で買って試してみるしかないですね。 もし大幅に感染効率が上がれば楽かな〜と思った次第です。

(無題) 削除/引用 No.2321-7 - 2010/04/01 (木) 12:11:26 - 小栗 Clontech社は３−４年ぐらい前にTarakaに買われまして、Lenti-Xのマニュアルには RetroNectin Reagent can be used to greatly improve transduction efficiencyと書いてあります。詳しくはマニュアルを参照してください。私には本当かどうかは判断できませんが。

(無題) 削除/引用 No.2321-6 - 2010/04/01 (木) 12:02:05 - ~ 私も一部の浮遊系細胞に感染させる際、苦労しておりますが、Takaraで売られているRetronectinを使えば、レンチでも実際のところ感染効率を上げられるものなのでしょうか？Takaraのサイトをみるとレトロほど効果はないが、レンチでもある程度の効果はあるとのことなのですが、、、。

(無題) 削除/引用 No.2321-5 - 2010/04/01 (木) 11:40:52 - 小栗 早速のコメントありがとうございます。 血清のロットによる違いがあるというのは、初耳でした。ただできれば血清濃度を下げたいのでpLenti6ではOPTI-MEM＋FBS２％で作成していましたが、pLenti7からはもう一度FBS10%からoptimizationをしています。ロットによる差も検討してみます。 Invitrogenのパッケージシステムと比べて３−４倍というのは、カタログ通りの数字ですね。宣伝にあるタイターは本当かもしれません。おっしゃる通り、InvitrogenのLenti vector(pLenti7)はSINのLTRなので、本来のHIVのLTRと比べてタイターが上がりにくいんだとおもいます。この二つのPlasmidのSequecen Allingmentをさせたら、違いはこの部分ぐらいです。 一度手に入れて試してみる価値がありそうです。 あと、Lenti virus のタイターはLTR間のサイズに指数関数的に反比例する（大体2Kb大きくなるごとに十分の一）という論文があるので、pLenti7のGFPのpromoterとsequence を外したもので試しています。

(無題) 削除/引用 No.2321-4 - 2010/04/01 (木) 11:05:42 - 匿名 Clontech社のシステムはpLVX系のベクターでフルの性能を発揮するようデザインされているそうです。 ところが残念なことにpLVXはLTRのプロモーター活性が残存しているため、日本国内の使用については大臣確認が必要になると思います。 米国ではそのような規制はないらしいのですが。 InvitrogenのpLenti系ベクターでClontech社のpackaging systemを使った場合、私の実験ではInvitrogen社のpackaging systemと比較して4倍程度のtiterのウイルス液が得られました。 メーカーにも問い合わせましたが、そのような使用法だとせいぜいその程度だということです。 やはり濃縮せずに使うことは困難だと思いました。 2nd generationのpackaging systemは3rdよりも高いtiterが得られるとよく耳にします。 3rdよりも安全性は劣るのかもしれませんが、2nd generationでもP2で使用できるものもあるようですので、所属組織の安全委員会に相談してみるのもよいかもしれません。 レンチウイルスのtiterは私にとっても悩みの種です。 よい方法をご存知の方がいらっしゃったら、私もご意見を伺いたいです。

もじばけしました、 削除/引用 No.2321-3 - 2010/04/01 (木) 09:19:19 - あああ 血清のロットによってもかなり違いがあるようです、と書いたのですが･･･。

ｲﾎｿｼ､ﾋ､ﾊ､熙ﾞ､ｷ､ｿ｡｣ 削除/引用 No.2321-2 - 2010/04/01 (木) 09:18:12 - ､｢､｢､｢ European Journal of Neuroscience, Vol. 24, pp. 371ｨC380, 2006 ､｢､ﾈﾑｪﾇ螟ﾎ･�･ﾃ･ﾈ､ﾋ､隍ﾃ､ﾆ､筍｢ｳ�ﾀｴ､ｬﾟ`､ｦ､隍ｦ､ﾇ､ｹ｡｣

Very high titer lentivirus の作成法。 削除/引用 No.2321-1 - 2010/04/01 (木) 05:39:43 - 小栗 Adenovirus の欠点が見えだして、３年位前からLentiに鞍替えしているんですが、やはりタイターが問題です。Antibiotics selectionでcell line を作るのは問題ないんですが、６well plate, 100 mm dish で培養しているprimary cell のほとんどの細胞をinfectionさせるだけのタイターをとるのは濃縮なしではなかなか難しい。 Clontech社で売っている4th generation Lentivirus packaging system は、100 mm の293T 一枚から濃縮なしで5x10^8 IFU/mlまでのタイター (HeLa cellで計測）のVirusが10 ml 取れるそうです。100 mm dishの培養細胞 には10 ulのsupernatant を使えば十分といいます。 現在使っているのはInvitrogenの３rd generationですが、どうがんばってもこの１０分の１以下のタイターです。 どなたか、このClontech社の製品 を使った経験のある人いますか。また、他の製品でもいいんですがHigh titer のlentivirusの作成法について試してみた方から意見をきければうれしいです。

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