Bio Technical フォーラム

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片鎖だけのRNAprobe合成 トピック削除
No.2319-TOPIC - 2010/04/01 (木) 00:34:29 - in situ
whole mount in situ用のRNAプローブを作っています。テンプレートはPCR産物で行いました。sense鎖、antisense鎖用のテンプレートの増幅に、それぞれ片方のPCRプライマー（sense用は遺伝子の5'側、antisense用は遺伝子の3'側）の5'端にT7 promoter 配列を付加してPCRを行いました。PCR産物はどちらも似たような収量で問題なく得られたので、これらをテンプレートとして用いてT7 RNA polymeraseによるin vitro転写を行いました。ところが、sense鎖しか合成ができません。これは、何が原因なのでしょうか。一つは、antisense鎖のテンプレートの末端が３’突出になっているとかあり得ますか？困っています。どうしたらいいかアドバイスお願いします。
　
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(無題) 削除/引用
No.2319-2 - 2010/04/01 (木) 12:13:03 - ああああ
まったく合成されないのでしょうか？
T7プロモーターの直後の塩基はGを入れておかないと収量が極端に落ちますが、その辺は大丈夫ですか？
情報が少ないので何ともいえませんが、Reverse primerの配列を開示したらどうですか？

片鎖だけのRNAprobe合成 削除/引用
No.2319-1 - 2010/04/01 (木) 00:34:29 - in situ
whole mount in situ用のRNAプローブを作っています。テンプレートはPCR産物で行いました。sense鎖、antisense鎖用のテンプレートの増幅に、それぞれ片方のPCRプライマー（sense用は遺伝子の5'側、antisense用は遺伝子の3'側）の5'端にT7 promoter 配列を付加してPCRを行いました。PCR産物はどちらも似たような収量で問題なく得られたので、これらをテンプレートとして用いてT7 RNA polymeraseによるin vitro転写を行いました。ところが、sense鎖しか合成ができません。これは、何が原因なのでしょうか。一つは、antisense鎖のテンプレートの末端が３’突出になっているとかあり得ますか？困っています。どうしたらいいかアドバイスお願いします。
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