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(無題) 削除/引用 No.2306-13 - 2010/03/30 (火) 08:22:38 - う ほとんどの細胞で発現するからアクチンでっていうのは理解できるが、 絶対にでる条件というのは、他の人が使って間違いなくシグナルが検出されると確認された サンプル（他の人が調整した、他の人が使っている細胞、他の人が行なった調整方法）、 １次抗体（他の人が使って検出できる抗体を分与、もしくは同じメーカーのもの）、 ２次抗体（他の人が使って検出できる抗体を分与、もしくは同じメーカーのもの）、 少なくとも、これらがきちんとそろっている、ということ。 このあたりが、全く情報提示されていない。 文面で、細胞をRipaで溶かしたとか書いても、他人にはわからないことだらけ。 実際、実験者の力量でサンプルがうまく出来ていないことなどよくある。 うまい人からはどうして失敗するかわからんが。 これは実際に見てみないと、何とも言えない。 １次抗体、２次抗体はいろいろなメーカーから販売されているが、 使えない抗体なんてザラに売ってある。そんな抗体でどうこう言っても意味が無い場合がある。 そもそも、ポジコンとは、実験に慣れた人だったらアクチンとかになるかもしれないが、 慣れていない人では、ポジコンにならないことがあるのは上記の通り。 何でもいい、ただ、「これでうまくいく」という少なくとも上記の３つを そろえることが必要かと。 それがポジコンです。

(無題) 削除/引用 No.2306-12 - 2010/03/29 (月) 23:35:03 - やま 二次抗体について書かれていないのですが、書き落としでしょうか？ 二次抗体があってるのかは大丈夫ですか？（マウスなのにラビット使ったりとか） 二次抗体の濃度はふってますか？ 自分が気が付いていない所があるかもしれないので、シグナルがでる他の人と一緒にやって貰うか見てて貰うと良いかもしれませんね。 抗体の原液はうちの研究室では絶対にボルテックスしません。やっている方法で抗体が取れていないという事はないと思います。（希釈する時にピペットの先から液が出ているのがちゃんと見えますか？（モヤモヤしたものが見える）

(無題) 削除/引用 No.2306-11 - 2010/03/29 (月) 22:56:49 - 実験素人 ご指摘ありがとうございます。 私は初心者であり、western blotをやり始めたばかりなので、 必ず出るといわれているβ-actinで練習しています。 自分なりに条件を変えて行ってみました。 フィルムに何も出ない(バックグラウンドも)ということから、 まず、SDS-PAGEでアプライするタンパク量を10μg、1μgとして多めに流しています。 Blottingでは転写の確認のためにメンブレンをCBB染色して、転写されていることが確認できました。 Blockingではoverblockingの可能性があるので5%,3%,1%BSAでそれぞれ行いました。 抗体反応はβ-actinの1000倍、500倍希釈のもので行いました。 抗体反応後のwashによって抗体が剥がれているかもしれないので、10min x3としていたのを5min x3としました。 Chemiluminescenceでは露光時間を2min、10minで行いました。 以上のことをやってみましたが、条件を変える前と同じく、フィルムには何も出ませんでした。 もっと他に考慮しなければならないところがありましたら、アドバイスお願いします。 それと一つ疑問があるのですが、抗体の希釈の際、抗体の原液が入っているチューブからピペットで取る前に、vortexを行ってもいいのでしょうか？ というのも、研究生に確認してもらいながら行ったときは、抗体の原液のチューブをvortexするように言われ、そのときは、弱いながらもシグナルが検出されました。他に操作が違っているところもなかったので、自分で行ったときは抗体が取れていなかったのかもしれないと思っています。 また、抗体原液からピペットで取るときに、自分はチップの外壁に抗体が付着すると希釈率が変わってしまうと思い、チップの先端のみを液につけ、ピペッティングして取っています。これでは抗体は取れないのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2306-10 - 2010/03/29 (月) 08:21:37 - う ポジコン、ネガコンなどは使って実験しているのですか？ まずは、絶対にシグナルがでるってサンプルでやってどうか？ 出ると思うのに出ないサンプルと、絶対に出ないネガコンとなるサンプルでどうなのか？ それをやるのが基本。 トラブルシューティングするためみ実験を組み立てることができるようになることも 実験をする者として必要なこと。 人に聞く前に、考えられる可能性を検討したのですか？その結果は？ それ以前に、自分で考えたのですか？考えたとしたら、何を考えたのか？ それを書き込んで相談した方が建設的。

(無題) 削除/引用 No.2306-9 - 2010/03/28 (日) 20:40:46 - AP 露光は2分だけですか。シグナルが出ない、弱いというならまず、露光時間を延ばして様子をみるのが常套手段だと思いますが。 どこに問題があるか、可能性のあるところを確認してトラブルシューティングしてみたらいかがでしょう。 すっかり何も出ない場合、ありうるのは ・標識酵素が失活している、あるいは基質が分解している →基質液に希釈した標識抗体を入れてみて光るかどうか（たとえば、ELISAプレートに基質液を入れて、標識抗体の希釈列を投入して、フィルムに乗せて露光するとか）。ほかのperoxidase標識抗体があったら、それでも同様にして光るかどうか。あるいは別の基質液（たとえばDAB）変えて反応が起こるかどうか。 ・現像液がへたっている。 →わざと感光させたフィルムを現像してみる。ちなみに、現像液が、低温（たひか18℃以下）だと現像がまったく進まず、真っ白になることがあります。現像液温度も確認してみてください。 以上で問題がなければ、実験そのものに原因があることになりそうですが、文面からだけでは判断のしようがありません。

(無題) 削除/引用 No.2306-8 - 2010/03/28 (日) 18:24:59 - 実験素人 アザイドは入れていません。 wakoのPBS粉末で1LのPBSをつくり、Tween20を0.5ml(0.05%)添加しました。 以前は同一ロットできっちりとバンドが出ていました。 初めはバンドが出なくても、バックグラウンドは少し出ていたのですが、最近は本当に何も出ません。 別の研究生に確認してもらったら、弱くではありますが、シグナルが検出されました。 しかし、その後、自分で行うと何も出なくなりました。 まだ、実験初心者でありますので、手順に不安なところが多々あります。 以下に私の実験手順を載せますので、何か間違っているところがあればご指摘お願いします。 接着性細胞をエッペンチューブに回収 ↓ 遠心、Ripa bufferで懸濁 ↓ 氷上で15min静置後、sonication 0sec or 10sec ↓ 遠心、上清をサンプルとする ↓ SDS-PAGE,200V,60min (1レーンにタンパク質が1µgになるように1xsample bufferで希釈し、apply) ↓ ゲル、メンブレンの平衡化後、Blotting,100V,60min,4℃ ↓ Blocking,60min shake (1%BSA) ↓ 抗体反応 1st β-actin,1/1000,overnight,4℃ wash 10min x3 (PBS-T) 2nd anti-mouse IgG antibody HRP-Linked,1/30000,60min,RT wash 10min x3 (PBS-T) ↓ Detection Immobilon chemiluminescent HRP substrate,5min,RT ↓ 露光 2min ↓ 現像 ハイレンドール(ハイレンドールを水で3倍希釈し、ストック。これをさらに5倍希釈して使用)

(無題) 削除/引用 No.2306-7 - 2010/03/28 (日) 17:52:04 - ｆｆ PBSTなどにアザイドいれてませんか？

(無題) 削除/引用 No.2306-6 - 2010/03/28 (日) 16:40:07 - 名無し太郎 >自分でPBSTを調整してから、シグナルが急にでなくなりました。 PBSTの組成とpHも再確認したほうがよさそうですね。 疑う場所が多数あるような場合、Bufferはできているものを買ってしまったほうが早いです。 バイオラッド、和光、ナカライなどから出ています。 ＰＢＳはＤＳファーマとか、タカラから錠剤を溶かすだけのものも出ていたと思います。（あとで自分で界面活性剤を添加してPBS-Tにします）

(無題) 削除/引用 No.2306-5 - 2010/03/28 (日) 14:47:54 - み >[Re:4] 実験素人さんは書きました : > それと一つ、気になることがあるのですが、 > 自分でPBSTを調整してから、シグナルが急にでなくなりました。 > PBSTはメンブレンの洗浄、抗体の希釈に使用しているのですが、 > PBSTを滅菌せずに使っています。 > もしかすると、これが原因ということはあるのでしょうか。 > western blotは無菌操作ではないので、滅菌していなかったのですが・・・ > 滅菌必要なし。 tween20の濃度が間違っているとか・・・・ 大抵メンブレン洗浄の際は0.05-0.1%で使用します。

(無題) 削除/引用 No.2306-4 - 2010/03/28 (日) 13:42:42 - 実験素人 早速の回答ありがとうございます。 ご指摘の点を確認したいと思います。 それと一つ、気になることがあるのですが、 自分でPBSTを調整してから、シグナルが急にでなくなりました。 PBSTはメンブレンの洗浄、抗体の希釈に使用しているのですが、 PBSTを滅菌せずに使っています。 もしかすると、これが原因ということはあるのでしょうか。 western blotは無菌操作ではないので、滅菌していなかったのですが・・・

(無題) 削除/引用 No.2306-3 - 2010/03/28 (日) 13:07:56 - 名無し太郎 ・今までその抗体と試薬の組み合わせ（同一ロット）で成功したことはありますか？ ・１次抗体または２次抗体が失活している可能性は？ ・当然のことですか動物種の組み合わせは大丈夫ですか？ ・多量の蛋白（50μg/レーンくらい）で流してもダメでしょうか。 ・研究室でウエスタンを行っているのは質問者様だけですか？　もし他にいらっしゃるならその方の結果は？ ・発色試薬は失活していませんか？詳細は忘れましたが2ndABと組み合わせて失活を確かめるプロトコールがあったと思います。（添付マニュアルまたはメーカーにお問い合わせください）

(無題) 削除/引用 No.2306-2 - 2010/03/28 (日) 12:28:37 - 実験素人 補足 1st antibody は1000倍希釈 2nd antibody は30000倍希釈で行っています。 よろしくお願いします。

western blotでシグナルが検出されない 削除/引用 No.2306-1 - 2010/03/28 (日) 12:25:47 - 実験素人 現在、western blotでたんぱく質(β-actin)の検出を行っているのですが、露光を行ってもフィルムになにもバンドが現れません。(フィルムは透明で、黒くなっているところはまったくありません。） メンブレンにたんぱく質が転写されているのか確かめるために、メンブレンをCBB染色してみると、バンドが確認できました。 すでに１ヶ月間この状態が続いており、原因がわからず非常に困っております。何かアドバイスがいただければと思い、今回、書き込みさせていただきました。 実験条件 1レーンあたりのたんぱく質量 : 1μg 1st antibody : β-actin, 4℃でovernight 2nd antibody : anti-mouse IgG HRP-Linked antibody, 室温で60min detection : Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate (MILLIPORE),室温で5min 露光時間 : 2min

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