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(無題) 削除/引用 No.2304-5 - 2010/03/29 (月) 11:05:36 - されど凍結 セルバンカーは少ししか使った事が無いので、的外れかもしれませんが、 （あと、B細胞リンパ腫細胞株は、扱ったことがありませんが） >保存条件：細胞浮遊液をtubeに入れ、on ice, 20 min後、冷やしたセルバンカーに入れ、-80 ℃ deep フリーザーに仕舞う。 「on ice, 20 min後」とは？？ 確か、セルバンカーシリーズは、細胞をセルバンカーに懸濁、チューブに分注後、すぐに−８０度で凍結だったような。 （従来の１０％DMSOで行うような、４度で少し冷やすといった操作は無しで） 「on ice, 20 min後、冷やしたセルバンカーに入れ」？？ タイプミスでしょうか？ あと、ここの掲示板でも有用な情報は得られると思いますが、商品開発会社に尋ねてみてるのも一つの方法かと。

(無題) 削除/引用 No.2304-4 - 2010/03/29 (月) 10:52:25 - み >[Re:1] 細胞保存についてさんは書きました : > 保存液：セルバンカー > 保存濃度：1 x 10E7の細胞を遠心にて落とし、mediumを吸引除去後、500 ul セルバンカーを加えています。（終濃度=1x10E7 cells/500 ul） > セルバンカーの量が10倍少ないような。 あとセルバンカーやDMSOを遠心で除去するまでは私も冷たいmediumでやりますよ。遠心後の細胞ペレットは温かいmediumに懸濁します。

(無題) 削除/引用 No.2304-3 - 2010/03/29 (月) 10:00:17 - 細胞保存について 細胞様 コメントありがとうございます。 ＜保存条件：細胞浮遊液をtubeに入れ、on ice, 20 min後、冷やしたセルバンカーに入れ、-80 ℃ deep フリーザーに仕舞う。 起こす時：細胞浮遊液を37℃ waterバスで（少し凍ったものが残った状態まで）溶かし、室温に戻したmediumで10倍ほど希釈し、1000 rpm, 4 min, 4℃で遠心後、3-5 mlのculture mediumでresuspend＞ >まず、大切な細胞はー80度で一晩凍らせた後、液体窒素のタンクで保存します。-80度では細胞がダメになることがあります。 はい。失礼しました。今回N2 liquidで保存した記述を省いておりました。 今回、細胞は-80℃で数日凍らせた後、液体窒素で保存しています。 >次に、細胞を起こす時には培地はあくまで37℃近くまで温めたものを用意します。細胞を起こすぎりぎりまで温めておいてからクリーンベンチに移します。それから、遠心は常温で行います。 私どもの上司からは、細胞を起こす際、37℃ waterバスで解凍後、37℃のmediumで希釈するのは避けるようにと教わりました。細胞にとっての温度変化がいきなりの37℃だと大きすぎるから、が理由だったかと記憶しています。「すぐ37℃でmediaを希釈すると細胞がやけどする」というか。 ですが、細胞様が行っているその方法ではviabilityがよいのですね。 私も次回そのように検討してみます。 ちなみに、細胞様が教示されたその扱いはどのような細胞株にしているものですか？ B細胞系リンパ腫細胞株の話ですよね？

Re：B細胞リンパ腫細胞株のストックの作り方 削除/引用 No.2304-2 - 2010/03/28 (日) 23:54:51 - 細胞 私も大体同じようなやり方で細胞をストックし、起こしていますが、下記の点が気になりました。 ＜保存条件：細胞浮遊液をtubeに入れ、on ice, 20 min後、冷やしたセルバンカーに入れ、-80 ℃ deep フリーザーに仕舞う。 起こす時：細胞浮遊液を37℃ waterバスで（少し凍ったものが残った状態まで）溶かし、室温に戻したmediumで10倍ほど希釈し、1000 rpm, 4 min, 4℃で遠心後、3-5 mlのculture mediumでresuspend＞ まず、大切な細胞はー80度で一晩凍らせた後、液体窒素のタンクで保存します。-80度では細胞がダメになることがあります。 次に、細胞を起こす時には培地はあくまで37℃近くまで温めたものを用意します。細胞を起こすぎりぎりまで温めておいてからクリーンベンチに移します。それから、遠心は常温で行います。培養は細胞数にもよりますが、10＾7の細胞だと、培地10ml/10cm dishで行います。 細胞を起こした時にどのくらい生きているか、トリパンブルーで測ることもあります。

B細胞リンパ腫細胞株のストックの作り方 削除/引用 No.2304-1 - 2010/03/27 (土) 12:47:11 - 細胞保存について みなさまご存知の方がいらっしゃいましたらどうか、教えてください。 最近、B細胞リンパ腫細胞株 Ramos, Daudi, Rajiなどを飼い始めました。 元気に増えたところで、細胞のストックを作り、後日それを起こすと99 %死滅するという状況が続いております。以下に保存条件を示しますが、もしコメントがありましたら、指摘していただけますと本当に嬉しく思います。お願いしますm(__)m 保存液：セルバンカー 保存濃度：1 x 10E7の細胞を遠心にて落とし、mediumを吸引除去後、500 ul セルバンカーを加えています。（終濃度=1x10E7 cells/500 ul） 保存条件：細胞浮遊液をtubeに入れ、on ice, 20 min後、冷やしたセルバンカーに入れ、-80 ℃ deep フリーザーに仕舞う。 起こす時：細胞浮遊液を37℃ waterバスで（少し凍ったものが残った状態まで）溶かし、室温に戻したmediumで10倍ほど希釈し、1000 rpm, 4 min, 4℃で遠心後、3-5 mlのculture mediumでresuspend→翌日ほぼ100 % 死滅 という状況です。 ちなみに、細胞を解凍後、遠心せずにculture mediumで希釈すると結構生き残っていたりします。しかし、この状態だとセルバンカーが残ってたりしますので、なんだか気持ち悪いです。 RIKEN CELL BANKで購入した場合には、解凍後、指示通り遠心しましたが非常にviabilityのよいものでした。 みなさんはどのようにB細胞リンパ腫細胞のストックを作っていますでしょうか？ 教えていただけますと幸いです。

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