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遅くなりましたが結果・・ 削除/引用 No.2300-5 - 2010/05/12 (水) 18:36:14 - 近道のはずが遠回り 結局，製品をそのまま用いて増幅させてみました． RT-PCRでバンドも確認し，想定内の大きさのバンドを確認しました． ゲル切りで従来通りの方法で標準液を作成しましたところ， real-time PCRには問題なく使用可能でした． プローブが入っていても，そのまま用いて問題なかったようですね・・ 御意見を下さった方々，ありがとうございました． （解決，ですが別のPCからでは駄目ですね・・）

(無題) 削除/引用 No.2300-4 - 2010/03/27 (土) 17:28:43 - 近道のはずが遠回り >ちょっとこのあたりがよくわからないのですが、今まではSYBR Greenを使った系でやっておられて、増幅後の溶液をアガロースゲル泳動してそこからバンドを切りだしてスタンダードにしていたということでしょうか？ この方法は一般的なものなのでしょうか？ 御指摘の通りです。 そのようにしてスタンダード作成していました。 >この部分に関しては恐らく、誤解されていると思います。 >スタンダードはreal-time PCRのテンプレートになるわけで、通常100bp程度が良いと言われるのはテンプレートの長さではなく、real-time PCRの増幅産物の長さです。 >ですので、上記の250-300bpをスタンダードとして用いるというのも、問題ないと思います。 その通りですね！御指摘有り難うございます。 間違いなくこの領域を含むテンプレートが，250-300bpであっても， この商品はApplied Biosystemsによるとreal-time PCRの増幅産物は1**bp（書き込んでよいものかわかりませんので伏せています）ということですから・・ 少し，長めのテンプレートを用意して， Pre-Developed TaqMan Assays Reagents を用いれば，測定は可能ですね！ なお，上記の情報については，Applied Biosystems社の製品説明書？に記載されています．別製品のCD-ROMにも入っているとも聞きました。

(無題) 削除/引用 No.2300-3 - 2010/03/26 (金) 16:49:20 - in situ >今までは、ゲル切りしてDNA抽出、 >塩基数と抽出DNA濃度からスタンダードのコピー数を計算していました。 ちょっとこのあたりがよくわからないのですが、今まではSYBR Greenを使った系でやっておられて、増幅後の溶液をアガロースゲル泳動してそこからバンドを切りだしてスタンダードにしていたということでしょうか？ この方法は一般的なものなのでしょうか？ 少し前にGAPDHの定量を行っていたときは、GAPDHのmRNAをプラスミドにクローニングしたものをスタンダードとして用いていました。 クローニングなどの技術がラボで確立されていないということでしょうか？ >ひとまず考えたのは，確実にプローブに含まれるとされる >塩基配列の○○○番目、増幅領域の塩基数から、 >この領域の前後をはさむprimerを設計し， >この製品に対する近似的な？スタンダード液を作ることでした。 >しかし、増幅領域がおよそ250-300bpになることから >Real timeには使えないのではと考えています。 この部分に関しては恐らく、誤解されていると思います。 スタンダードはreal-time PCRのテンプレートになるわけで、通常100bp程度が良いと言われるのはテンプレートの長さではなく、real-time PCRの増幅産物の長さです。 ですので、上記の250-300bpをスタンダードとして用いるというのも、問題ないと思います。

(無題) 削除/引用 No.2300-2 - 2010/03/26 (金) 15:41:27 - ザンギ >しかし、増幅領域がおよそ250-300bpになることから >Real timeには使えないのではと考えています。 このように考える根拠がよくわかりません。 後学のためにも教えてください。

Pre-Developed TaqMan® Assay Reagentsについて・・ 削除/引用 No.2300-1 - 2010/03/26 (金) 10:22:45 - 近道のはずが遠回り Pre-Developed TaqMan Assays Reagents を用いたGAPDHの測定について質問です。 今までは、ゲル切りしてDNA抽出、 塩基数と抽出DNA濃度からスタンダードのコピー数を計算していました。 しかし、TaqMan probe法でターゲットを測定することになり、 GAPDHについては、今回Applied Biosystemsの 4352934E Human GAPDH (NM_002046)（FAM/MGB プローブ)を 使用することになりました。 PrimerとProbeの混合液の製品ですが，いざ測定の段階で、 従来通りの方法ではスタンダード液が作れないことがわかりました。 情報としてあるのは、 増幅領域の塩基数とおよその増幅領域のみです・・ 多くの研究者に使われています。とのことですが、 周囲に使用者がいませんでした・・ ひとまず考えたのは，確実にプローブに含まれるとされる 塩基配列の○○○番目、増幅領域の塩基数から、 この領域の前後をはさむprimerを設計し， この製品に対する近似的な？スタンダード液を作ることでした。 しかし、増幅領域がおよそ250-300bpになることから Real timeには使えないのではと考えています。 Probeを含む製品で従来通りゲル抽出を行ってスタンダードを作ることも考えています。 でも、微量ながらFAMが残ってしまいますよね？ 検出に影響がないのか心配ですが、 今のところこの二つの方法を試してみようと思っています（正しいのかはわかりません・・）。 Real time PCRにはTakaraのDiceを使用しています。 ABI PRISMのようにこの製品の コピー数を決めてくれるような機能はありません。 素直に配列を指定して注文すればよかったのですが、 なんとか使いこなしたいと思います。 詳しい方からのご教示をいただけないでしょうか？ よろしくお願いいたします。

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