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(無題) 削除/引用 No.2291-4 - 2010/03/25 (木) 20:28:23 - c すでにアドバイスが出ているように、BCA protein assay で行えば、SDSを含むサンプルでも問題なく蛋白質定量できます。ただbMEとBPBはこのassayを妨害しますからこれらは定量後にsampleに加える必要があります。最近はbMEもOKのBCA assay kitも売ってるらしいです。 興味ある蛋白質が特に存在量のきわめて少ない蛋白質でない限りは、SDS lysis bufferで細胞を溶かして細胞内全蛋白質を得て、western blottingに使っていいと思いますし、これは日常的によく行われる方法です。ただDNAが出てきて粘性をもつので、ソニケーションなどでDNAを切ってサラサラににてから使います。そうしないと電気泳動のパタンがなんか変な感じに乱れてたぶんうまくいきません。 triton のbufferで可溶化するならば、上澄み（核以外）沈殿（核画分）それぞれについてwestern blottingをしてみれば核移行の様子も含めてより多くのinformationが得られるので、sds-sample bufferによるwhole cell lysateとともにこれもやってみる意義は十分あります。なお沈殿のほうは電気泳動のためのSDS処理でDNAが出てきますから上記のような処理が必要です。

(無題) 削除/引用 No.2291-3 - 2010/03/25 (木) 00:51:46 - う ＞みなさんはこういった活性化すると（一部）核移行するMAPKなどみる場合にトライトンを用いた実験は避けるべきなのでしょうか？ それともSDS-sample bufferなどで核膜を溶かした方がよいでしょうか？ どっちもやればいいのでは？ たいした手間でもないでしょう。 ＞個人的にはSDSでの可溶化はタンパク定量を行いたいため避けたいです。。 定量する方法は先の回答者様がおっしゃる通り、いろいろあるし。 細胞数をあわせたり、内部標準であってるか確認したり、いろいろいろあるでしょうし。 方法論のために目的を設定するのではなくて、目的のために方法を設定しましょうよ。 〜な目的の実験をする必要があるから、それを実現するために方法がないか考えませう。 定量することが目的であればSDSでの可溶化を避けるというのであればわかりますが、ちがうでしょ？

(無題) 削除/引用 No.2291-2 - 2010/03/24 (水) 22:30:52 - toyo >活性化すると（一部）核移行するMAPKなどみる場合にトライトンを用いた実験は避けるべきなのでしょうか？ 細胞質画分だけの活性化を見たいのか、それとも細胞全体の活性化を見たいのか、など あなたの研究の目的に依存するので、今提示されている情報だけでは的確な答えができないのではないでしょうか。 それから、BCA法なら数%のSDS存在下でもタンパク定量を行うことができると思いますが、いかがでしょうか。

ERK, p38, JNKのリン酸化をみる際のdetergentについて 削除/引用 No.2291-1 - 2010/03/24 (水) 21:38:54 - 核内移行 教えてください！ 最近、western blotを始めた者です。 癌細胞をIGF刺激してAktなどのリン酸化をこれまでに検討しておりました。 この時に使用したlysis bufferはセルシグナリングの10 x lysis bufferというものを1 x に希釈してProtease阻害剤など加えた上で、使用して、良好な結果を得ておりました。 なにも考えず、先輩からERKやp38といったMAPKのリン酸化も調べるようにと言われ、そのようにするつもりですが、cell lysateも残り少なくなり、どのみち細胞を再度刺激してlysateを作り直さねばならないんですが、ちょっと考えました。 pERKとかpp38というのは核内に移行すると思います。 僕のプロトコルではトライトンX100で可溶化したので核膜は溶かせておらず、むしろ脱核してしまっております。 みなさんはこういった活性化すると（一部）核移行するMAPKなどみる場合にトライトンを用いた実験は避けるべきなのでしょうか？ それともSDS-sample bufferなどで核膜を溶かした方がよいでしょうか？ 個人的にはSDSでの可溶化はタンパク定量を行いたいため避けたいです。。 どうかお力添えをお願いします！！

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