全5件 ( 1 〜 5 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.2285-5 - 2010/03/24 (水) 15:43:20 - Tg AP様 ありがとうございます。理解できました。 HEK293 細胞は adeno virusを感染させて樹立した株だと思いますが、 同じような原理で通常は組み込まれないような adeno virus DNAが 組み込まれていると考えていいのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2285-4 - 2010/03/23 (火) 21:50:18 - AP >�@ 修復機構が働く為には実際に二本鎖DNAの切断を誘導する必要があるかと 思いますが、TgのDNAを雄性前核に注入した後は何が誘導しているのでしょう か？ >�B この時の二本鎖DNAの切断は何が誘導しているのでしょうか？ 環状プラスミドのかたちで準備されたベクターは、適当な制限酵素で直鎖状にしてから導入するのが普通ですね。そうしたほうが遺伝子導入効率が高いということが経験上知られているからですが、二重鎖切断端を作っておくほうが、修復系にかかりやすいというのが理由ではないかと思います。 環状で導入した場合は、おそらく内在性のゲノムがそうであるように、トポイソメラーゼが二重鎖切断を起こすのではないでしょうか（ゲノムDNAだって、頻繁に二重鎖切断と再結合を繰り返しているものですから）。 >�A Tgの場合、DNAが組み込まれる際にタンデムに挿入される事が多いと思いますが、これは修復機構で説明がつくのでしょうか？ >�C KOのターゲティングベクターがタンデムに入らない理由はなんでしょうか？ 二重鎖切断を再結合する際、相同配列を持つ鋳型がなく、組換え修復ができない場合、強制的に末端同士を結合するnon-homologous end-joining (原核生物でいうSOS修復のような）系があります。その過程でベクターの重合がおこるのではないかと想像します。

続・染色体への外来DNAの組み込み 削除/引用 No.2285-3 - 2010/03/23 (火) 17:38:50 - Tg AP様　早速のご返信ありがとうございます。 AP様及び分かる方がいらしましたら、またいくつか教えてください。 �@ 修復機構が働く為には実際に二本鎖DNAの切断を誘導する必要があるかと 思いますが、TgのDNAを雄性前核に注入した後は何が誘導しているのでしょう か？ �A Tgの場合、DNAが組み込まれる際にタンデムに挿入される事が多いと思いますが、これは修復機構で説明がつくのでしょうか？ また、KOを作る際のターゲティングベクターも修復機構の相同組み換えを利 用していると知りませんでした。勉強になりました。ありがとうございます。 �B この時の二本鎖DNAの切断は何が誘導しているのでしょうか？ �C KOのターゲティングベクターがタンデムに入らない理由はなんでしょうか？ 質問が多くなり申し訳がございませんが、 分かるもので範囲で結構ですのでご指導ください。

(無題) 削除/引用 No.2285-2 - 2010/03/23 (火) 16:03:57 - AP 経験則、方法論として確立されたことであり、目的から言ってそれで十分でもあるので、機序についてしっかり研究されているのか、定説がどうなっているかはよくしりません。 しかし、遺伝学の一般論から演繹すると、DNA二重鎖切断の修復機構がはたらくことによって、インテグレーションが起こるんだと思います。 導入したDNAの両末端にある二重鎖切断端は、ゲノムDNAの二重鎖切断と同じように修復すべきものとして修復系に認識され、組換え修復の鋳型としてゲノムDNAが使われる結果、挿入を持つ染色体を生じるのでしょう。 ターゲティングはまさに相同配列間での相同組換え修復によります。たんなるTgのように、両端に相同配列を持たないベクターの場合でも、非常時にはゆるい相同性から組換え修復系が働きうるためのランダムな挿入が起こるのではないでしょうか（実際、ターゲティングベクターでも、非相同領域の挿入は頻繁に起こるわけで）。 一般的に、環状プラスミドのまま導入するより線形化したほうがはるかに効率が良いと言われるのも、この辺に理由があるのだと思っています（環状DNAは、内因性の系で切断されないと修復系にかからない）。

染色体への外来DNAの組み込み 削除/引用 No.2285-1 - 2010/03/23 (火) 14:48:24 - Tg いつも勉強させていただいています。 どなたかご指導お願いいたします。 トランスジェニックマウスの染色体への外来DNAの組み込みは どういったメカニズムでおこなわれているのでしょうか？ 宿主由来の酵素か何かが必要なのでしょうか？ どうぞよろしくお願いいたします。

全5件 ( 1 〜 5 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---