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(無題) 削除/引用 No.2283-10 - 2010/03/24 (水) 14:40:38 - もねりん himawari　さま アドバイスありがとうございます LPSやPHAでの刺激は与えず、培養フラスコから剥がし細胞数を一定に調整した細胞液を９６穴プレートに入れ刺激物質を直接感作させ一定時間（２０時間）培養後上清を回収し測定しています。 フラスコからの回収時に同じ数増えているように播種していますが、確認はしていないです 先輩が行っていたデーターに基づき播種量や培養条件をそのまま引き継いでやってしまっています。すみません う　さま ご指摘のように実験データーを扱うのはほぼ初めてです。 ＜数回やった実験の結果をまとめてやるとおかしいならば、 ＜個別にグラフにしてみてグラフのバーの大きさはちがうかもしれないが＜＜傾向が同じ」であるならば、それは結果として正しいのかもしれないし。 →まさにここなんです グラフにしてみたところ3回の結果の数値としての差はあるもののグラフの形は同じでピークの部分も同じサンプル濃度で出ています。。 同じサンプル感作濃度で比較すると同程度の割合で差があるので結果として用いても良いのではないかと思い上司に相談したのですが、堂々めぐりになってしまいました。 思い込みをなくしてもっと勉強します ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2283-9 - 2010/03/24 (水) 13:43:27 - う 訂正 ＞あまり良く変わっていない →あまりよくわかっていない。

(無題) 削除/引用 No.2283-8 - 2010/03/24 (水) 13:42:08 - う あくまで参考に。 細かな数値の差を言い出したら、ある意味キリが無いのではないかと思うところもあります。 逆に毎回同じような値が出るって熟練者でもむずかしいことがありますし。 そのブレを神経質に考え込む前に、何も考えずに、その複数やった実験の結果を統計学的に処理して、グラフなどを作った時にどうなるのか、やってみて考えては？ 前にも書いたが、そのときのグラフの傾向が「増加している（有意差がある）」のであれば それはそれで１つの結果ではと思いますが。 論文でも３回やった実験のうちのrepresentativeデータを示すとある。 （示した以外の結果がどうなのか、知る由もない。） 数回やった実験の結果をまとめてやるとおかしいならば、 個別にグラフにしてみてグラフのバーの大きさはちがうかもしれないが「傾向が同じ」であるならば、それは結果として正しいのかもしれないし。 私には、細胞操作のこともあるが、実験のデータ処理についてまだあまり良く変わっていないと思われる。先輩に聞いた方がいいと思います。 あまりにブレが大きいなら、「細胞の扱いが下手くそ」orそもそもそんな「増加は起こっていない」か、のどちらか。 これ以上は、 細胞に関しては現場にいる先輩に扱いを習うのが一番だし、 実際の実験がわからないから何とも言えない。 最後に、検討することが悪いとは言いません。 しかし、どんな実験でも万能に理想通りになるとは限らないことです。

(無題) 削除/引用 No.2283-7 - 2010/03/24 (水) 12:42:47 - himawari どなたか書いていましたが、細胞をそろえる処置は重要です。 LPSやPHAなどを加えるとき、18〜24時間のstarvationしていますか？ 接着細胞を使っているようですが、接着している細胞数は同じですか？ （浮遊している細胞はないか？） starvation時のwash out等で細胞が剥がれ、ばらついてはいませんか？

(無題) 削除/引用 No.2283-6 - 2010/03/24 (水) 11:58:33 - もねりん う　さま ご意見ありがとうございます ご指摘のように簡単に簡単に考えすぎているようです 腹腔細胞で行うより差が小さく出るものと勝手に期待しておりました 会社に羊土社の本ありますので再度読み直します。 結果のズレとしては毎回同じサンプルを同じ濃度で感作させ、同じ条件培養していても結果に差があるということです 例えば１回目５００、２回目１０００、３回目７５０といったような数値の違いが出ます 腹腔で行っていたときはサンプルとコントロールを置き、コントロールとの比で結果を修正していました もし、細胞の継代間のズレだとすればその方法でよいかと思うのですが、現在の結果のズレを細胞間のズレと決め付けるわけにも行かず、一つ一つの条件をつぶしていくしかないにしてもデーターの見比べをこのまま行っていいものかと悩んでいます DC　さま アドバイスありがとうございます おっしゃるとおりELISAで測定しています ELISAでの作業は保存してあったサンプルで再測定を繰り返し差がないことを（冷凍保存してあるサンプルでも問題ないことは検証済みです）確認しております。 感作させるサンプルの処理も毎回同様に行っている（時間、希釈など）のですがもう一度確認してみます。 現在は１．継代 　　　２．培養フラスコからサンプルを剥がして感作させるために細胞数の　　　　　調整をし、播種する。 　　この２点の作業の人的差によって結果にバラツキがあるのでは？と上司　　に指摘されています。　 （継代時の培地やそれに入れるFBSのLOTも同じものです） 　　自分の未熟さゆえに先に進まない感があり、質問も的を得ず申し訳ないです。

(無題) 削除/引用 No.2283-5 - 2010/03/24 (水) 11:01:07 - DC う、さんの仰るように、PrimaryにしてもCell lineにしても、活性を持っている以上細胞を培養するという事は非常に難しいものです。 慣れた人でも、毎回同じ『絶対値』を出すのはかなり難しいのではないでしょうか。 。 つまり、もねりん、さんが行なっていてうまくいっていないと感じている実験結果は培養細胞の状態ももちろんですが、サイトカイン産生を誘導する何かしらの刺激物自体の活性や、培養上清に産生されているであろうサイトカインの濃度を測定するELISA（おそらく）系など、パラメーターは沢山あると思います。 このようにパラメーターが多数あり、実験のLotごとに絶対値（測定値）が異なるために、コントロールを設定し、相対的な優位差や相対的な増加・減少をもって実験結果を考察するのだと私は思っています。 もし、絶対的な値が必要であれば、何か一つの活性をコントロールにおいて（例えば、その刺激で明らかに産生される目的とは別のサイトカインなど）、そのコントロール値が一定になるような刺激濃度（感作濃度）を設定しなければ難しいと思います。 ただこれは、う、さんが最後に仰っている「10倍の時もあるけど2倍の時もある」ような、相対値が異なる、という場合にはやはり細胞や実験系、試薬等が実験ごとに質が異なっているためではないかと思いますが…

(無題) 削除/引用 No.2283-4 - 2010/03/24 (水) 10:32:00 - う 培養細胞の扱いは、簡単なように思う人がいますが、 その実、経験を要します。 質問者様は、簡単に考えてすぎているのだと思います。 まず、培養細胞は、「単純に」継代の数だけでその状態を語ることは出来ません。 下手な人であれば、１回継代しただけで細胞がおかしくなることもあり得ます。 また、時間にシビアに行なえば良いということでもありません。 まずは、初心者用の細胞培養の指南書は羊土社などから出ていますので 基本をおさえることをお勧めします。 それよりも、その「半年は使える」と言っている先輩につきっきりで細胞の維持の仕方を盗むことをお勧めします。 細胞を維持するということはかなりむずかしいものなのです。 簡単に書きますが、 継代する時に細胞が多すぎてしまうと、継代の細胞の状態にかなり影響します。 この「多すぎる」というのも、細胞によってかなり異なります。 培地が黄色くなってしまっているのは論外ですが、そうでなくても影響することはあります。 そして、継代するときにまく細胞数。 多すぎても少なすぎても、その後の細胞の状態に影響します。 あと、 ＞実務を担当する先輩に相談した所、継代した細胞の能力に保証はないから３つの実験内容の数値を比べるのは意味がなく、ずれているのが当たり前との事でした。 そのズレが、例えば「Aを加えると活性が増加する」ということが、 あるときは「Aを加えても増加しない」というほど、ずれるということを想像しているのであれば それは、結果として採用できません。 あくまで、「Aを加えると活性が10倍増加する」ときもあれば 「Aを加えると活性が２倍増加する」ときもある、というズレは細胞の状態などなどで変化するときもあるかと思います。 しかし、３回やって、その「増加する傾向がある」のであれば、それは３回する意味がある（というかそれを確かめるためにやるべき）と思いますが。 一体何を想定してその人は言っているのか、わかりません。

(無題) 削除/引用 No.2283-3 - 2010/03/24 (水) 09:11:31 - もねりん amiさま アドバイスありがとうございます 新しいものを起してまだ６回くらいしか継代していません。 そのうちの４，５、６回目を実験に使用しました。 先輩は半年は使えると言っていたので継代数の少ないうちから差が出るものなのかと疑問に思っています 逆にまだ安定していなくばらつくのかとも考えたのですが初めて実験に使う際には先輩に細胞を確認してもらってから使用したので大丈夫かとも思います。 継代する際には目的の日に同じ状態になるように調節していますが確かに実験の作業開始時間や、継代時間がずれています。（大雑把に２、３日という感じで調整しているので数時間のズレがあるということです） もっと、時間にシビアに行いたいと思います。 細胞は今使用しているのだけでやりくりをと言われているので新しいものを起すことは今のところ出来ませんが、時間等の条件や操作のチェックを行い改善策が見出せればと思います。 細胞のサブクローニングも検討してみます。

(無題) 削除/引用 No.2283-2 - 2010/03/24 (水) 00:03:27 - ami 継代が進めば徐々に状態は変化します。同じ日に作った凍結ストックから実験すれば改善するのではないでしょうか。継代が進んだ細胞しかないのであれば、一旦サブクローニングしてみてはどうでしょうか。 それ以外にも、 細胞密度は同じでしょうか。 植え継ぎしてから実験までの時間は同じでしょうか。 細胞の状態をそろえるような処置はしていますか（Serum Stervationなど）。 などなど。

培養細胞の基礎知識 削除/引用 No.2283-1 - 2010/03/23 (火) 13:58:09 - もねりん 培養細胞を使用したサイトカイン測定の条件決めを行いたいと思っています 今までマウス腹腔細胞で行っていたのですが個体差が大きいために培養細胞で行えないか検討中です。 培養細胞初心者のため伺いたいことがあります 同一条件で継代をし、培養日数も同じ細胞でサンプルの感作濃度のみを変えて最適なサンプル感作量を求めようと思いました。 ３度同じ実験を行い、グラフにすると同じカーブを描くグラフが取れたのですがサイトカイン誘導能のピーク値が５割ほどの差が出来ました。 マウスの個体差同様に継代差のようなものがあるのではないかと推測しましたがこの考えは間違っているでしょうか。 このことを上司に相談しました。 私個人の技術の未熟さなのか細胞の能力差なのかを検討する必要があるのでは？という回答でした。 実務を担当する先輩に相談した所、継代した細胞の能力に保証はないから３つの実験内容の数値を比べるのは意味がなく、ずれているのが当たり前との事でした。 当たり前だとしたらグラフのカーブやピークが同じということで徐々に条件を狭めて条件付けを行っていいものか考え込んでしまいます。 培養細胞に関する文献や基礎的なHPや文献を探したり、似たような条件付けを行っていそうな文献を探し上司に相談しているのですが遅々として進まずあせっています。 １．マウスの個体差同様に継代差のようなものがあるのではないかと推測しましたがこの考えは間違っているでしょうか。 ２．グラフのカーブやピークが同じということで徐々に条件を狭めて条件付けを行っていいものか考えてしまっています。 以上、２点なにかs難航になる文献等ありましたらお願いたします。

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