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ISHプローブ回答ありがとうございました 削除/引用 No.2273-3 - 2010/03/21 (日) 18:32:48 - air Eireさん アドバイスありがとうございました。 ＞うろ覚えなのですが、SP6 プロモーターは鋳型の端にある場合は SP6 polymerase がうまく結合（認識？）できない、というのをどこかで（Ambion のホームページだったかな）で読んだことがあります。 SP6polymeraseが転写効率がT7に比べて悪いということ をきくのですが、それはこの理由なのでしょうか？ ＞なので、同じ PCR 産物が異なった方向で入った２つのプラスミドがあるのであれば、各プラスミドから増幅した PCR 産物を鋳型に T7 RNA polymerase で転写したセンス、アンチセンス RNA を作るか、あるいは、 T7, SP6 配列の外側の配列をプライマーに使って PCR をして、プロモーター配列が PCR 産物の端から内側にあるようにすればどうでしょうか。 正順、逆順に入っているもの両方でT7 polymerase、SP6 polymerase でtranscription 行ったところ（計4サンプル）、sense鎖しか できませんでした。 なので、1方向にしか転写がうまくいっていないということなので、 塩基配列によって転写しやすさ、しにくさなどがあるのかな、と思った次第です。 ちなみにISHしたいのは受容体です。 T7,SP6配列外側の配列をプライマーにしてPCRという方法、 検討したいと思います。

(無題) 削除/引用 No.2273-2 - 2010/03/20 (土) 22:18:44 - Eire air さん > 正順、逆順にインサート（プローブ配列）が入っているもの > をそれぞれT7 polymeraseと SP6 polymeraseで転写させたのですが > 両方とも、sense鎖しかうまくできませんでした。 これは、T7 あるいは SP6 RNA polymerase のどちらかの RNA polymerase で転写したものしかうまくできなかった、ということでしょうか？ もしそうだとして、T7 を使ったものだけバンドが検出できたというのであれば、あり得ることだと思います。 うろ覚えなのですが、SP6 プロモーターは鋳型の端にある場合は SP6 polymerase がうまく結合（認識？）できない、というのをどこかで（Ambion のホームページだったかな）で読んだことがあります。 なので、同じ PCR 産物が異なった方向で入った２つのプラスミドがあるのであれば、各プラスミドから増幅した PCR 産物を鋳型に T7 RNA polymerase で転写したセンス、アンチセンス RNA を作るか、あるいは、 T7, SP6 配列の外側の配列をプライマーに使って PCR をして、プロモーター配列が PCR 産物の端から内側にあるようにすればどうでしょうか。 ちなみに私は、アンチセンスプライマーの 5'-end に T7 promoter 配列を付加したものと何も付加していないセンスプライマーで増幅した RT-PCR 産物を精製したものを in vitro transcription の鋳型によく用いますが、全く問題なく転写されていることを申し添えておきます。

ISH　sense,anti-senseプローブ作製iｖｔについて 削除/引用 No.2273-1 - 2010/03/20 (土) 19:50:27 - air 現在in situ hybridizationに用いるプローブをつくっています。 プラスミドベクター（pGEM-Teasy）にプローブ配列を導入し、 T7−SP6プライマーでプローブ配列を増幅させました。 その後ウィザード精製し、in vitro transcription したのですが、 正順、逆順にインサート（プローブ配列）が入っているもの をそれぞれT7 polymeraseと SP6 polymeraseで転写させたのですが 両方とも、sense鎖しかうまくできませんでした。 (anti-sense 鎖は電気泳動確認でバンドがきれいに出ず、 スメアになってしまった) 塩基配列によって転写しやすさに差はあったりするのでしょうか？ 同じ時に違うものがプローブ作製を行って成功はしているので 試薬等の問題はないと思います。 研究者としては未熟なのですが、よろしくお願いします。

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