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(無題) 削除/引用 No.2269-7 - 2010/03/20 (土) 02:19:46 - ７７４ すでに回答していらっしゃる方と同様に、とりあえず質問の意味が意味不明です。 ただその上で答えられることと言うと、経験上ですが、まず ・テンプレートを疑ってみる。ゲノム等は凍結融解を繰り返すとあまりPCRが走らなくなると感じます。 ・さらに、PCR products自体も凍結融解や４℃保存等でも何故かバンドが薄くなってしまいます。４℃だと一晩でも結構・・・ ・プライマーは凍結融解を繰り返すとダメだとか色々言われていますが、私はプライマーは物によって(使用頻度が高いものや、使用量が多いもの)は常温に置いてたりします。数ヶ月は問題無くPCRははしっています。というか使用できなくなったことはありません。 ・以前一度、プライマー合成を依頼している会社が合成を行う設備を変えたことによりオリゴの配列にミスが複数入るということが続いたことがありました。当時はシークエンスによってそのことを明らかにして、会社を変えました。合成の条件が合っていなかったことが原因だったようです。現在はinvitrogenで合成を依頼していますが、問題があったことは一度もありません。 plecoさんの言うとおり、もし後染めを行っているなら、エチブロが薄くなってるのではないでしょうか？ 確認程度の泳動なら最初からゲル自体にエチブロを入れてしまえばいいです。エチブロはオートクレーブにかけても失活しないので。

(無題) 削除/引用 No.2269-6 - 2010/03/19 (金) 21:52:20 - かけだし 泳動バッファを多数回使いまわしておられるとか・・・ 10回近く流すと、バンドが分散したように薄くなってくることがあると思うのですが（原理は知らないのですが）。

念のため確認 削除/引用 No.2269-5 - 2010/03/19 (金) 16:05:15 - pleco PCRに問題があるのではなく、その後のバンド染色のほうに問題があるということは ありませんか？ 例えば、EtBrはずーっと使い回していると染まりにくくなった経験があります。

(無題) 削除/引用 No.2269-4 - 2010/03/19 (金) 15:46:09 - P 例えば、100サンプルあるとして それはテンプレイト以外は全く同じ組成なのでしょうか？ 要するに、１から泳動始めて後半の番号になるとバンドが検出しづらくなるということでしょうか？ ＞もしくは昔のサンプルを取りだしてきてもう１度流すなど その「昔のサンプル」とやらは、一度濃いバンドが出ていることが確認された物が もう一度流すとバンドが薄くなるということでしょうか？ 単に、サンプルの保存が悪いのでは？

補足 削除/引用 No.2269-3 - 2010/03/19 (金) 15:23:37 - なぜだ〜！！！ 言葉足らずで申し訳ありません。 サンプルに１から番号を付けており、１〜１０番というように、１枚のゲルに対して、１０サンプルずつ電気泳動しているのですが、７０番をこえたあたり（もしくは昔のサンプルを取りだしてきてもう１度流すなど）から、バンドが濃く出ずに、気持ち出てるかな・・・？というぐらいにしか、バンドが出ません。要は最近電気泳動するサンプルは全部綺麗にバンドが出ません。 昔の状況とは、バンドが濃く太くはっきりと出た状態を示しています。 プライマーの分注状態がいまいちなのかと（古いのかなと・・・）思って、新しく注文しなおすことを考えております。今注文しているところは、マイナーな会社で、量が元々少ないので、SIGMA辺りに頼んでみようかと思ってます。

(無題) 削除/引用 No.2269-2 - 2010/03/19 (金) 14:48:34 - P 基本的にどういう状況かということと、何が問題かというのがわからないです。 ＞最近（特に７０サンプルをこえたあたりから）バンドが思うように出ません。 ということは70以下のサンプルでは思うようにバンドが出ているということなのか？ ＞ここ最近はほとんどバンドが出なくなりました。 ＞バシっと濃いバンドを昔のように出したいのですが 最近は、全くバンドが出なくなったのか？ 「昔のように」とはどいう状況のことを言っているのか？ どいう状況を目指しているのか？ ＞今考えているのは、プライマー（１番怪しいとふんでます）を別の会社に新しく受注することと、 これがなぜ、70サンプル以下のものではOKで、それ以上はダメな原因と考えるのか？ これらがよくわからないです。

ＰＣＲのバンドをしっかり出したい！！ 削除/引用 No.2269-1 - 2010/03/19 (金) 14:19:19 - なぜだ〜！！！ 今まで１００サンプル以上、同じ条件でＰＣＲをかけて、ポリアクリルアミドゲルを使い電気泳動をしているのですが。 最近（特に７０サンプルをこえたあたりから）バンドが思うように出ません。 確かにアニーリングの設定など、ギリギリでやっているのですが、昔はtaqなど新しいものに変えたり、分注したプライマーを別の分注した容器から使用してみたりと、１度でバンドがでなくても、２〜３度試薬等を変えてやれば、なんとかバンドが出ていたのですが・・・ ここ最近はほとんどバンドが出なくなりました。 ＤＮＡ抽出方法は、冷凍標本とパラフィンからと両方ありますが、抽出に問題はないと思います。 バシっと濃いバンドを昔のように出したいのですが、何が問題と考えられますでしょうか・・・？ 今考えているのは、プライマー（１番怪しいとふんでます）を別の会社に新しく受注することと、使っているすべての試薬も新しく注文しなおす・・・と考えてますが、何か他に問題があるようなら、教えていただきたいと思います。 よろしくお願いします。

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