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(無題) 削除/引用 No.2255-10 - 2010/03/19 (金) 13:51:51 - 774 APさん コメントありがとうございます。実はタンパク質用の膜と核酸用の膜を重ねたら出来るんではないかと妄想したのですが・・・今回は珍しくない普通の方法でやります。

(無題) 削除/引用 No.2255-9 - 2010/03/19 (金) 13:38:22 - AP >両立できるのでしょうか？できるのであれば、方法を教えてください。宜しくお願いします。 そういう手技は聞いたことないけれど、もしやろうとしているならチャレンジングだなあと思っただけでして。 やるとしたら、まずメンブレンが問題になるでしょうね。タンパク質と核酸、両方に適したメンブレンがないので。一応、バックが高くなるという問題があるようですが、ナイロンメンブレンでもWesternは不可能ではないそうですが。 あるいはin-gel Westernなら両立できるかも。 DNA結合タンパク質は、一般的に塩基性タンパク質なので、等電点の高さが問題になるかもしれませんね。バッファのpHをかなり高くしないと、トランスファされにくいかも。

(無題) 削除/引用 No.2255-8 - 2010/03/19 (金) 00:36:56 - どら 直接の質問への回答ではありませんが、EMSAのスーパーシフトは、はじめの目的への解法のひとつですね。既に考慮されていたらすみません。

(無題) 削除/引用 No.2255-7 - 2010/03/18 (木) 21:41:15 - 774 cさん、ザンギさん、あべちゃんさん 貴重なコメントありがとうございます。早速やってみたいと思います。 APさん 興味深いコメントありがとうございます。そういう意味ではないです。ですが、両立できるのでしょうか？できるのであれば、方法を教えてください。宜しくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.2255-6 - 2010/03/18 (木) 18:40:45 - AP Native-PAGEでWesternというのは特にめずらしい手法ではないと思いますが、 ひょっとして、EMSAと両立できるか、ということなんでしょうか。 つまり、シフトしたバンドの、核酸プローブの検出と結合タンパク質の免疫検出、両方出来ないか、ということでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2255-5 - 2010/03/18 (木) 17:03:45 - あべちゃん あ。 高濃度のSDSが残っているとPVDFに移りにくくなるので、１）の洗いはちゃんとやる。

(無題) 削除/引用 No.2255-4 - 2010/03/18 (木) 17:01:47 - あべちゃん しょっちゅうやってます。 私は、2つの方法を使い分けています。 １）トランスファーバッファーのSDSを１％に上げて、15分ほどタッパーで振った後に、いつものトランスファーバッファーでゲルを軽く洗う。そして、いつものようにセミドライでトランスファーする。 ２）Nativeのゲルをいつものようにトランスファーする。ただし、Wet式で、4度、30V 16時間くらい。 １）は簡単かつ1日で出来るけど、転写効率は普通のSDS-PAGEに比べてかなり低い。 ２）はしっかりうつりますが、Wet式タンクを一晩がめる。

(無題) 削除/引用 No.2255-3 - 2010/03/18 (木) 16:39:58 - ザンギ 基本的には可能です。 SDSが無くてもゲルの中を泳ぐたんぱく質ですから、膜への転写もできます。 SDS-PAGEでないとWBできないような1次抗体の場合には、転写前後のいずれかで 還元したりバッファー置換したりする必要があります。

(無題) 削除/引用 No.2255-2 - 2010/03/18 (木) 12:23:52 - c やった事ないですが理論的には出来るとおもいます。ただ未変性なので複合体とかはそのままなので全体として天然状態の蛋白質の形ゆえ高分子量のものが多いこと、またゲルから膜への移動は蛋白質の荷電に依存することになるので、転写効率はあまり良くないことが予想されます。なので転写に先立って低濃度のSDS（0.2~0.1%くらいあるいはもっと必要かも）でゲルをしばらく平衡化する(15~30分くらい）とか、transfer bufferに低濃度のSDS(0.2~0.05%くらい）入れるとかした方がいいと思います。

native-PAGE後にWB 削除/引用 No.2255-1 - 2010/03/18 (木) 11:24:28 - 774 EMSAを行っており、目的タンパクの位置を知るためにnative-PAGE後にタンパクの抗体でWBをやりたいなと思っています。SDS-PAGE後の時と同様に行えばうまくいきますでしょうか？論文では見たことがあるのですが、実際にやったことがある方に経験談をお聞きしたいです。

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