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皆様　本当にありがとうございます。 削除/引用 No.2244-19 - 2010/03/19 (金) 22:25:29 - さと 皆さま、~さま 様々なアドバイス、右も左もわからない初心者の私にありがとうございます。 先ずは、皆さんのアドバイスを念頭にトラブルシューティングリストを作って ひとつずつチェックしていってみたいと思います。 PCRに関して、ｄNTP、テンプレートを代えて、 プライマーの希釈液も新しく作り直してみて、 同じプライマーでバンドを見ることが出来ました！ 皆さんが書いて下さっていた通り、 ポリメラーゼの問題というよりは、 他の溶液の問題だったと理解しています。 ただし、ウマクいったのは4本目のチューブで、 3本目のチューブは弱いバンドしか見られませんでした。 場合によってはキットを変更することも考慮してみたいと思います。 本当にありがとうございました！

(無題) 削除/引用 No.2244-18 - 2010/03/18 (木) 16:44:49 - ~ >が、自分の使っているポリメラーゼでのバンドが見たいので、 ポリメラーゼの能力がギリギリで、どこかのパラメーターが微妙に変わっただけで、 結果が出るときと出ないときがあるのかもしれません。 力をどこに入れるかは、一度は考えた方がいいと思いますよ。 結果が出来るだけ早く欲しいのであれば、結果が得られればいいのですし、 今後も安定な検出系として使いたいのであれば、駄目になりやすい系では今後もトラブルが起こりうるでしょう。

皆様。本当に感謝です！ 削除/引用 No.2244-17 - 2010/03/18 (木) 15:44:11 - さと ばいや　さま テンプレートは冷凍保存している物を冷蔵庫内で融解しています。 凍結融解の繰り返しでテンプレートが分解されてしまうという可能性も 考えるべきでしょうか？ ~　さま 細やかなアドバイスを本当に有難うございます。 プライマー原液からの希釈は、予備実験の段階からTrisではなく DNaseフリーウォーターを使用しています （これはプライマー製造元の指示に従っています）。 確かに、本実験のためにプライマーを希釈しなおしたので、 次回は予備実験の希釈液も融解して、 新しい希釈液と比べてみたいと思います。 PCRマシーンのプログラムはチェックしてみましたが、 上書きなどの間違いは無かったようです。 実際に、同じプライマー、テンプレートにdNTPを用いて、 他の人から貰った他の会社のポリメラーゼキットでPCRを行ってみたところ、 綺麗なバンドを見ることが出来ました。 ・・・が、自分の使っているポリメラーゼでのバンドが見たいので、 ~　さまのアドバイス通り、幾つかの組み合わせを試してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.2244-16 - 2010/03/18 (木) 14:12:52 - ~ まずは、 １．現在使っているポリメラーぜ、dNTP、buffer ２．全部新しいそれらの試薬（又は他の人や他のラボからちょっと貰う） A．昔走ったプライマー、ゲノムセット B1．他の人が増やしているプライマー、テンプレートセット B2．使えるプライマーがラボにある適当な配列が挿入されたプラスミド の１、２と、A、B1 or B2のそれぞれの組み合わせでどれが増えるかを確認してみてはいかがでしょうか。 結果の組み合わせで、どの部分に問題があるかが分かると思います。 また、PCRマシーンのプログラムを間違えていたり、誰かに上書きされていたかも、 確認事項の1つだと思います。 そういえば、プライマー原液からの希釈は何でやっていますか？ 予備実験ではTrisバッファーだけで希釈していて、 >本実験のため冷凍しておいたプライマー原液を解凍後希釈して、 でTEで希釈したために、マグネシウムがキレートされていたりしませんか？ 予備実験で使っていた希釈プライマーが残っていたら、それもPCRに使ってみてはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2244-15 - 2010/03/18 (木) 13:07:36 - ばいや テンプレートがゲノムですか？ テンプレートの保存状態あるいは扱いが悪かった可能性があるのでは？

ポリメラーゼとプライマーの扱い方 削除/引用 No.2244-14 - 2010/03/17 (水) 23:20:18 - さと ~さま 度重なるお返事ありがとうございました。 ｄNTPに関してのお答え、安心しました。 本題ですが、先ずはここ3ヶ月くらいはtemperaturgrandientPCR を行って、プライマーの効率&シークエンスへの適性を チェックしてきました （その間、元々のプライマー原液は冷凍保存です）。 10数ほど有るシークエンスそれぞれに 適当なプライマーとTm温度を調べ、 シークエンサーにかけて、プライマーのゲノム解析への適応性を チェックした後、本実験に入りました。 本実験のため冷凍しておいたプライマー原液を解凍後希釈して、 PCR増幅を行っています。 そこで、temperaturgrandientPCRの際に、 電気泳動のバンドが得られたプライマーを再度解凍希釈して PCRを行いました。プロトコルも全く同じものを使用しています （PCR産物の大きさによってプログラムを改良してきました）。 それで、PCRが上手くいった時のテンプレートで PCRを繰り返してみましたが、電気泳動のバンドが見られませんでした。 そこで、「各種溶液の保存方法」に気が行ってしまっていました。 引き続きよく考えながら実験を続けてみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.2244-13 - 2010/03/17 (水) 18:34:01 - ~ 見過ごして書いてしまいましたが、dTNPが3回の凍結融解でおかしくなることは無いと思います。 また、この質問は試薬の取り扱いについての基礎的な質問ではなく、 トラブルシューティングについてですよね。 4本のチューブというのはサンプルではなく、DNAポリメラーゼのチューブのことですよね。 >400〜800bpの長さの産物増幅を目標にPCRを行っています と書かれていますので、異なるプライマーの組み合わせで、 長さが異なる産物を得ようとしているのですよね。 （ダイレクトシークエンシングをしていますので、テンプレートも複数なのですよね） テンプレートの精製具合や濃度の違い、 プライマーごとのTm値や増幅効率、濃度などの違い などの理由で、異なるテンプレートやプライマーのサンプル間で、 増幅産物量に違いがあっても何も不思議は無いのですが。 そのため、書かれている情報からでは、 ３，４本目のチューブの増幅が悪いことが、 試薬や材料の劣化と判断するのは早すぎると思います。 １，２本目のDNAポリメラーゼで増えたサンプルをもう一度4本目のDNAポリメラーゼで増やしてみましたか？

(無題) 削除/引用 No.2244-11 - 2010/03/17 (水) 18:17:15 - ~ >テンプレートもやはり凍結融解の繰り返しで >分解されてしまうという心配もあるのでしょうか？ >dNTPは3度くらいの凍結融解で分解してしまう物なのでしょうか？ どちらも、凍結融解も4度保存も、分解する可能性はあると思いますが、 貴方の場合はそれとは異なるトラブルが生じているのだと思います。 そのため、今回の対処法としては、保存方法の変更よりも、 問題の原因の追究の方がいいと思います。 個人的には、dNTPの小分けは現実的ではなく、 （1mLくらい入っているのに、1回の使用は数uLですよね） 4度保存は気持ち悪いです。

テンプレートの保存法ですが。。。 削除/引用 No.2244-10 - 2010/03/17 (水) 16:58:48 - さと ophitesさま、USBさま 再び申し訳ありません。 テンプレートもやはり凍結融解の繰り返しで 分解されてしまうという心配もあるのでしょうか？ こちらも「冷蔵か冷凍か」と保存方法を考えてしまいます。 お手数ですが、もう一度お返事いただけたら嬉しいです。 勝手ながらヨロシクお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.2244-9 - 2010/03/17 (水) 16:29:11 - さと USB　さま 有難うございます。 dNTPは3度くらいの凍結融解で分解してしまう物なのでしょうか？ こちらも希釈して使用しているので、 希釈液の小分けしたものは使い切る（または再度使用しない） 様にしたいと思います。 貴重なご意見有難うございます。

皆様。有難うございます！ 削除/引用 No.2244-8 - 2010/03/17 (水) 16:24:19 - さと Ophitesさま、通りすがりさま、ザンギさま、ばいやさま お返事有難うございます。皆さんの貴重な意見に大変感謝しています。 希釈したプライマーは、小分にして冷凍又は冷蔵保存して、 原液はやはり冷凍保存してみようかと思っています。 なるほど、酵素の攪拌よりも、Template、バッファー、dNTPにプライマーと 他の条件をフレッシュな物に全て変えてPCRし直してみたいと思います。 また、TemplateのDNA含有量も測りなおしてみます。 プライマーについてももう少し調べなおしてみたいと思います。 PCR自体はキットの製造元のプロトコルに基づいて行っています。 全て一新しても上手く行かなかったら プライマーも新しく注文しなおしたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.2244-7 - 2010/03/17 (水) 16:22:22 - USB さと様 　私も皆様とほぼ同意見です。 primerは基本100uMの冷凍保存しております。そこから10uMに希釈し使用していますが、それも冷凍保存しています。また、100uMで調整したprimerは数年冷凍保存したものを使用したことがありますが問題になったことはありません。 ちなみに溶媒は純水（注射用水）です（TEの方がいいんでしょうが、楽なのと問題になったことがないので）。 　ポリメラーゼに関しては、ボルテックスは教科書的には禁忌ではなかったでしょうか？ただ、私が学生だったころ、一時期vortexをしていたことがあります。その時にはたまたまPCRは走りましたがボルテックスはしない方が良いと思います。 　ポリメラーゼは購入したチューブから攪拌等はせずに使用しています。これも問題になったことがありません。 　やはり私もテンプレートかprimerを疑います。再度、ミニプレして酵素の切断パターンや濃度に問題なければ primerを購入しなおすという方向でしょうか？ 　また、可能性は低いですがdNTPも凍結融解で分解するので、dNTPも新しいものを使用するとかぐらいですね。

(無題) 削除/引用 No.2244-6 - 2010/03/17 (水) 09:08:38 - ばいや ポリメラーゼは攪拌したことがないです。大丈夫と分かっていても、タッピングなんかで熱を与えるのが嫌で。蓋についているときは軽く遠心して落としています。ボルテックスはしないです。 プライマーは凍結融解を繰り返しているとダメになってくると聞いています。本当かどうか知りませんが、プリン塩基が剥がれてくると聞きました。プライマーは水で溶かして凍結しています。凍結融解を繰り返すのは希釈したものにしておきます。一週間に何度も使うときは4度においておくこともあります。そんなに気にすることはないでしょう。 で、何が悪かったのか？文章では分かりませんが、テンプレートとプライマーがあやしいです。pUC系プラスミドとM13プライマーなどのセットで確認してみてください。条件も標準のもので反応させてください。上手く行くはずのセットがワークしなければポリメラーゼも含めて他が悪そうです。

(無題) 削除/引用 No.2244-5 - 2010/03/17 (水) 08:28:33 - ザンギ プライマーの保存ですが、100μMのTE溶液なら遮光4度で数年間は問題あり ません。配列によっては分解する可能性はあるかもしれませんが、そういう のは経験上１％以下です。 プライマーの希釈が必要なら、使いきれる分だけ調製します。

プライマーでは 削除/引用 No.2244-4 - 2010/03/17 (水) 05:21:58 - 通りすがり 　経験と勘からですが、なんとなくプライマーが怪しい気がします。コストを考慮しても、やはり、次の一手は、Freshなプライマーを使うということになるかと思います。 　私は、プライマーは必ず毎回冷凍します。この繰り返しによって痛むことはあるかと思いますが、少量を分注したものを使っているので、特に気にしていません。 　冷蔵しない理由は、４℃だと分子が簡単に移動でき、お互いにべたべたくっつくのではないかという気がするからです。もちろん、そういうことがあったとしても、denatureできるはずなのですが、なんとなくこのことが気になるのでいつも冷凍してしまいます。

解決策は分かりませんが・・ 削除/引用 No.2244-2 - 2010/03/17 (水) 01:48:23 - ophites 正直なところ、何が原因で1, 2本目ではうまくいき、3, 4本目ではダメなのか読む限りでは判断できませんが、自分のプライマー、酵素の扱いについて述べさせて頂きます。 まず、プライマーですが、凍結融解を繰り返すことが良くないと言われているので（これはプライマーやPCRキットの説明書などにも書かれている場合が多いです。）冷蔵で保存しています。説明書では冷蔵保存で一ヶ月とか三ヶ月とか書かれていたように記憶していますが、経験上、数ヶ月以上冷蔵保存していたものでも特に問題無く増幅できています。 次に酵素のグリセロール液ですが、一応使用する前はタッピングして混ぜ、その後、チビタンで軽く遠心してフタについた液をチューブの底に落としています。グリセロール液は粘度が高いので、ピペットで混ぜるとチップに付着してしまった分の損失がばかにならないので、ピペットで混ぜるという方法はとっていません。ボルテックスを使用するのは怖いのでやったことがありません。（本当にダメなのかどうかは分かりませんが）ただ、グリセロール液は冷凍庫でも凍結しないので、ボルテックスほど激しく混ぜなくても、本来それほどチューブ内で不均一な状態になるものではないはずです。 buffer, dNTPには問題が無いということでしたが、templateの状態も疑ってみた方が良いかもしれません。

ポリメラーゼとプライマーの扱い方 削除/引用 No.2244-1 - 2010/03/17 (水) 00:56:43 - さと 皆さんのトピを読みながら色々学べさせて頂いています。 ただ今、400〜800bpの長さの産物増幅を目標にPCRを行っています。 TemplatesをPCRで増幅後に、ゲル電気泳動により増幅を確認した後に DNAを回収後、シークエンサーによるゲノム解析を最終目標としています。 グリセリンと共に保存された、DNAポリメラーゼが50μl（250unit） のチューブ×4本が入った某キットを購入して、 2本目のチューブまでPCRも上手くいっていたのですが 3本目と4本目のチューブでは上手く行きませんでした （ゲルのバンドシグナルが大変弱い状態）。 注文したキットが到着してから、 即−20℃に保存した状態で有効期限も切れていません。 自分として考えられるのは、 　　　　−　何らかの理由で酵素が失活した 　　　　−　ポリメラーゼが均一ではなかった の2つの理由です。。。 ポリメラーゼは使用前にピペットでユックリ混ぜてから 使用しているのですが、ボルテックスシェーカーで混ぜるくらいが ポリメラーゼを均一にするのにはいいのでしょうか （自分は酵素が壊れるのが心配で恐る恐るなのですが）？ ちなみに、バッファー、dNTPは同じものを使用して、 2本目のチューブでゲルバンドがシッカリ確認できたので、 問題ないと思っています。 また、プライマーですが、人によって 「余り冷凍を繰り返さないで冷蔵保存がいい」という人と、 「絶対冷凍保存しないとだめだ」という人が居て迷うのですが、 数ヶ月間の冷蔵保存でプライマーが駄目になってしまうものなのでしょうか？ PCR初心者なゆえ、当たり前のような質問かも知れませんが、 専門書など読み直してもどうもシックリとくる答えが見つかりません。 ・・・皆様のアドバイスを頂けたら嬉しいです。 宜しくお願いいたします。

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