動物細胞のextractを使ってIP実験をしているのですが、incubate中に抗体とビーズの架橋が外れてしまい困っています。
抗体はラビット抗体で、ビーズはProteinA−Dynabeadsを使用しています。
架橋にはDMPを使用しています。
架橋後に酸（PH2.5）を用いて溶出し、SDS−PAGEで確認したところ抗体の溶出はほぼ確認されませんでしたので、架橋はうまくいっていると考えています。
実際に、chromatin fraction など、タンパク量の少ないfractionを使ってIPした場合には抗体が外れてくることはありませんでした。
ところが、タンパク量の多いCytoplasmic fractionを使った場合にのみ、抗体が外れてきます。exrtract中のprotease活性が高いため、ProteinAそのもの、あるいはProteinAに架橋された抗体がproteaseによって切断されることで、抗体がビーズから脱離するのではないかと考えていますが、本当の所はわかりません。（IP-bufferにProtease-Inhibitorは加えています。）
銀染色で確認すると抗体のバンドだけ太く濃く染まってしまいます。
最終的にはMSで免沈産物の同定を行いたいのですが、この外れ方だと抗体のコンタミが甚だしく同定が困難になると予想されます。
同じような経験のあるかた、何かアドバイス等ありましたらぜひ教えてください。お願い致します。 |
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