全8件 ( 1 〜 8 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.2228-8 - 2010/03/17 (水) 20:03:40 - azuki そもそもTCA沈殿する必要ってありますか？ ラットの肝臓を10倍くらいのbufferでsuspensionにしてますよね？ TCAと一緒に凝集した膜成分も落ちるから溶けにくくなるのは当然だと思います。 そうか、TCAを使わなければいけないぐらい微量タンパクなんですね。

(無題) 削除/引用 No.2228-7 - 2010/03/17 (水) 13:02:44 - ｃ 蛋白質は変性して凝集しているので単に中和しただけでは再溶解は難しいと思います。TCA沈殿してアセトンまたはエタノールで洗浄したときは、乾かないうち（半乾きくらい、ちょっとまだ湿ってるかな？くらい）にSDS-sample bufferを加えるのが結構大事です。いったん乾かしてしまうと再溶解させるのはこれはけっこう難しいですし、どんなにがんばってもしばしば絶望的なこともあります。あと気のせいかもしれないですがSDSでなくて8MUreaの方がこの沈殿は溶けやすい印象があります。またアセトンやエタノール洗浄は１回だけだと十分に除酸できない場合がしばしばありますので出来たら２回やった方がいいです。特に沈殿の量が多いとき。ただ沈殿が微量のときはかえってロスしたりどっかにくっついてなくなったりする恐れがあるので１回でとめた方がいいです。 組織量に対するホモジナイズのbuffer量を考慮すればTCAで濃縮しなくてもよいのではないでしょうか。すくなくとも肝臓なら10%ないし5%ホモジネートならばその必要はないくらいの蛋白質濃度になると思います。 強アルカリにさらすのは蛋白質にはあまりよくないとおもうので、直接NaOHを添加するのは大丈夫かなとおもいました。

(無題) 削除/引用 No.2228-6 - 2010/03/16 (火) 03:58:01 - Kanata >[Re:5] ともさんは書きました : > しかし、今度はTCA沈殿が溶解せずに困っております。 > 少し調べたところ、TCA沈殿はアセトンや冷たいエタノールで数回洗浄して、酸性を中和した後、バッファーを加えれば溶解するという記述を見かけました。 > 今回は中和のために0.1%のNaOHを加え、チップの先で沈殿を潰し、超音波にかけましたが、沈殿はほとんど溶解しませんでした。 アセトンや冷エタノールで洗浄して残っているＴＣＡを除去することで不溶化を防げるはずです。コツがいるかもしれません。 NaOHは、使ったことありません。

(無題) 削除/引用 No.2228-5 - 2010/03/16 (火) 01:24:53 - とも みなさま、すばやい回答ありがとうございました。 核画分に生じた粘性のものは、アドバイスどおり超音波処理をすると、なくなりました。 また、上清については 今回の実験ではミクロソーム画分とミトコンドリア画分を分けずにタンパク濃度を測定したいために、TCA沈殿を行いました。 しかし、今度はTCA沈殿が溶解せずに困っております。 少し調べたところ、TCA沈殿はアセトンや冷たいエタノールで数回洗浄して、酸性を中和した後、バッファーを加えれば溶解するという記述を見かけました。 今回は中和のために0.1%のNaOHを加え、チップの先で沈殿を潰し、超音波にかけましたが、沈殿はほとんど溶解しませんでした。 NaOHでは沈殿を中和するという機能は果たさないのでしょうか？ それとも、そもそもの考え方が間違っているのでしょうか？ 重ね重ねすみませんが、教えてくださると幸いです。

(無題) 削除/引用 No.2228-4 - 2010/03/14 (日) 21:27:40 - ＴＳ 粘性のあるモノの正体は、他の方のご指摘の通り、ゲノムでしょう。 ＷＢの前にタンパク質濃度を測定したいのであれば、やはりなんらかのLysis Bufferに懸濁するのが良いでしょうね。 Bufferを加えた後に、ゲノムを細断するために、シリンジを通すか、超音波をかけて、タンパク質濃度測定、WBと進めていけばよいと思います。

(無題) 削除/引用 No.2228-3 - 2010/03/14 (日) 20:29:18 - c Western blotting が目的ならば、NP-40 bufferでけんだくする必要はないと思います。またNP-40は核蛋白質を可溶化には適切ではないように思います。 沈殿を直接SDS-sample buffer で溶解し（DNAによりかなり粘稠になるかもしれません）、シリンジあるいは超音波で粘性がなくなるまで軽く処理したのち遠心して上清を粗核画分とするということではどうでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2228-2 - 2010/03/14 (日) 16:59:23 - こうじ サンプルを凍結融解しているから細胞破砕が行われていそうなので 粘性の原因はDNAを疑うのが一番では？ DNaseを加えるか、針付きシリンジなどでシェアするなど しないと遠心がうまく行かないと思いますけど 実験目的を達成するにはこれが原因ではこのサンプルからは難しそうですね、、、

肝臓のタンパク検出 削除/引用 No.2228-1 - 2010/03/14 (日) 16:39:56 - とも ラットの肝臓から目的のタンパク質を検出する、という実験を 肝臓をホモジナイザーですりつぶす ↓ 4000rpm 5分で遠心 ↓ 沈殿（核画分）と上清（ミクロソーム＆細胞質画分）にわける ↓ それぞれをバッファー（NP-40）で懸濁 ↓ タンパク濃度測定＆ウェスタン という流れで行うように指示を受けました。 しかし、遠心を行った結果、沈殿内にどろっとした粘液のようなものがあり、バッファーで懸濁できません。 この粘液のようなものは何なのでしょうか？ また、今までは、タンパク抽出の際 遠心を繰り返し、核画分・ミトコンドリア画分・ミクロソーム画分に分けて、各ペレットが十分に懸濁出来る量のバッファーを添加するという方法をとってきたために、すでに、液体状態にある上清に添加するバッファーの量がいまいちわかりません。 今回はじめて肝臓（凍結肝臓）を扱ったために、どのような手が最善なのかがわかりません。 もしよろしければ、ご教授していただけないでしょうか？

全8件 ( 1 〜 8 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---