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WBは？ 削除/引用 No.2226-10 - 2010/03/15 (月) 23:29:57 - 通りすがり 　WBでシングルバンドになるということを示すのではダメでしょうか。 　もちろん、WB用のサンプルと組織切片内では抗原の状態に違いはあると思うので、シングルバンドになっても、特異性の完全な証明ではないかもしれません。 　しかし、不完全性ということについては吸収実験でも言えますよね。つまり、吸収実験でネガティブでも、その抗体が目的の分子とともに別の分子も認識しているという可能性は排除できないわけですから。 　完全性ということはおいといて、Reviewerをまあまあ納得させるというのであれば、WBでも大丈夫かなと思うのですが。

(無題) 削除/引用 No.2226-9 - 2010/03/15 (月) 20:37:31 - c エピトープ領域あるいはメーカーが抗体を作る時に抗原として使った領域が分かっているならばペプチド合成に外部委託して作ってもらえばどうでしょうか。この場合は純度とかはそんなに重要でないとおもうのでそこそこでいいとおもう。いろんなメーカーが受託合成やってます。価格はまちまちですが。あまり長いと難しいかもしれないけど、20〜30残基前後の長さくらいまでならできるのでは。抗原領域教えてくれないならば、リコンビナント蛋白質として大腸菌に発現させて作るとかもありかもしれない。

(無題) 削除/引用 No.2226-8 - 2010/03/15 (月) 18:16:26 - よし みなさまありがとうございます。 ペプチドを購入して試してみようと考えてメーカーに問い合わせてみたのですが、コントロールペプチドは販売しているが、今は在庫がなく、国内外とも製造するかどうかは未定といわれました。 今回はそのためネガコンのみでとりあえずトライしてみようかと思ってますが、ペプチドやたんぱくの入手方法ってなにかほかにありますでしょうか

(無題) 削除/引用 No.2226-7 - 2010/03/15 (月) 10:11:49 - TK-1 > 特に後者のほうの抗体の特異性を証明するには、以前の論文で特異性が示された抗体と同じクローンの市販のものを使用してポジコンもきれいに出ている、といった内容で十分なのでしょうか？ 特異性の証明はポジコンでは何も言えません。例えば強制発現のポジコンで染まったからといって、その抗体が他の分子を認識しない（これが特異性の定義です）ということに関しては何も言えないからです。ネガコンで染まらないということが必要です。KOがあればそれに越したことがありませんが、無いのであれば元々その分子を発現している細胞でRNAiで発現を抑えた時にシグナルが消えるかということが必要かと思います。

(無題) 削除/引用 No.2226-6 - 2010/03/15 (月) 09:03:19 - ST いえいえ。吸収実験というのは、この一次抗体の標的タンパク質、あるいは配列ペプチドと一緒に（プレインキュベーションもありだと思います）、一次抗体反応をするというのものです。 この方法で擬陽性シグナルなどを完全に否定できるものではないと思いますが、抗体の特異性をアピールするときに一般的に使われますね。

(無題) 削除/引用 No.2226-5 - 2010/03/15 (月) 00:40:29 - よし みなさまご意見ありがとうございます。USBさんのおっしゃる通り、間違いです。すいません。 さっそく吸収実験をやってみようと思いますがやったことがないので、教えていただきたいのですが。 標的臓器の切片上に一次抗体をかけて4度オーバーナイトで反応させて吸着させる、といった方法でよいのでしょうか？ すいませんが詳しくないので正しい方法を教えてください。

(無題) 削除/引用 No.2226-4 - 2010/03/14 (日) 19:05:58 - c 抗原とした蛋白質なり部分ペプチドなりで吸収あるいは競合させた時にシグナルが、無処理群（通常の方法）とくらべて減弱することを示すのがいいとおもいます。抗原の量が不足だと吸収しきれずに、シグナルが出てしまうので、少し条件振ったほうがいいかもしれません。 また両者は可能な限り同時に並行して行なわないと対比が難しいです。

(無題) 削除/引用 No.2226-3 - 2010/03/14 (日) 17:51:55 - ＴＳ 完全無欠の正解があるわけではないのですから、 吸収実験、１次抗体なし、をやったら、標的以外の臓器のデータも併せて、レビューアーは納得してくれるのではないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2226-2 - 2010/03/14 (日) 17:44:40 - USB よしさま >同じクローンの抗体できれいに染まるということで教えてもらったものを購入しております（ポリクロ）。 この表現がよくわからないのですが… クローンなのにポリクロなのですか？？？ それはさておきまして、目的のタンパク質の発現ベクター等は作成できないのでしょうか？膜タンパクだから難しい面もあるかもしれませんが、可能ならばHA,FLAG,GFPなどとの融合タンパク質をvitroで発現させて、抗タグ抗体との共染色することで証明できないでしょうか？

市販の抗体で免疫組織染色した時の特異性の証明 削除/引用 No.2226-1 - 2010/03/14 (日) 15:03:40 - よし いつも参考にさせていただいております。 免疫組織染色はあまり得意ではないのですが、蛍光組織染色を用いた論文がリバイスでかえってきました。 ある２つの膜蛋白の局在を2重染色して証明する内容なのですが、２つとも市販の抗体を使用しております。標的臓器以外の臓器でのポジコンは以前の報告と同じような染まり方をし、それも論文中で示していたのですが、抗体の特異性を証明せよとレビューアーに言われました。 抗体の１つは既存の論文で使用されていたものを購入しました（モノクロ）。もう一つは全く同じ抗体を使用した論文はないのですが、同じ膜蛋白の免疫組織染色をしている論文の著者に抗体を譲ってくれないかと頼んでみたところ、同じクローンの抗体できれいに染まるということで教えてもらったものを購入しております（ポリクロ）。 特に後者のほうの抗体の特異性を証明するには、以前の論文で特異性が示された抗体と同じクローンの市販のものを使用してポジコンもきれいに出ている、といった内容で十分なのでしょうか？

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