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(無題) 削除/引用 No.2224-11 - 2010/03/29 (月) 20:27:16 - ami 遅返信ですいません。 自作といってもラボのほかの人が作ったコンピテントセルでしたが、自分で作ってみたら2x10^8/ug DNAくらいのができました。で、それでやったら、プレートを埋め尽くすほどのコロニーが出ました(1000個以上？)。効率が100倍だとこんなに違うんだなぁと思いました。効率が悪いとこんな数個とかしかでないんだなぁ、数字以上に違うんだなぁと思いました。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2224-10 - 2010/03/16 (火) 23:58:28 - ami いろいろ返信ありがとうございます。悶絶していて返信が遅れました。 > ポリメラーゼによってはブラントエンドになるとか。 > 3'-末端にA(アデニン)が付加されないPCR酵素(TaKaRaのPrimeSTARシリーズなど)を使用→PCR酵素の変更(TaKaRaのExTaqシリーズなど) ExTaqとQuick TaqなのでたぶんAがついてます。最後の72deg,7minもちゃんとやってます。 > 絶対コンピタントセルの問題です 早くコマーシャルなものに変えれば全てうまくいきます > プラスミドと大腸菌の相性→大腸菌又はプラスミドの変更 > ＴＡクローニングでコロニーが少ないとき、色々と検討していたのですが、結局コンピテントセルを新しくしたらコロニーがたくさん出るようになりました。 そうする方向性であります。ありがとうございます。 > PCR産物を直接使用している→泳動＆ゲル切りだしを行う 切り出しするのと切り出ししないのと試してます。 > 大腸菌の保存が冷凍庫(-20〜30℃)などで行われている→-80℃に保存するようにする -80度保存してます。温度上がっちゃったりとか、開け閉めしすぎたりしてないです。 > クレーム出して新しいロットにかえてもらったらあのロットはなんだったんだ？ってなりました 出してみます。 - - - やっぱり、あまりたくさんいじれるところがないので、コンピテントセルを検討してみるのが第一っぽい印象です。

(無題) 削除/引用 No.2224-9 - 2010/03/14 (日) 17:56:21 - こうじ ほとんど同じ経験があります クレーム出して新しいロットにかえてもらったら あのロットはなんだったんだ？ってなりました ネタっぽく聞こえますがクレームおすすめです

(無題) 削除/引用 No.2224-8 - 2010/03/14 (日) 17:49:15 - 細胞 そうですね、まあ目的のバンドがdominantであればそのままもいいかもですね。 そうそう私もPfu turboでPCRした後、Taq polでお尻にAを付加させ忘れるときあります（笑） でもamiさんならそんなミスはしないでしょうし、なにより他のポジコンではうまく行くとのことですから、E coliを変えてみるのも手ですね。 あるいはわざわざTA cloningかませず、direct cloningしても良いでしょう。

(無題) 削除/引用 No.2224-7 - 2010/03/14 (日) 17:27:46 - けん ＴＡクローニングでコロニーが少ないとき、色々と検討していたのですが、結局コンピテントセルを新しくしたらコロニーがたくさん出るようになりました。 [Re:2]さんの PCR product 2 ul (ゲルから切り出したもの) Salt 0.5 ul TA vector 0.5 ul --------------- 30 min, r.t ↓ 2 ulをDH5αにtransform 私もこのような量でやっていますが、自分のラボではPCR productはPCRしたものをそのまま使用しており、ゲルから切り出したりしていません。 でも普通にコロニーが出ていますが皆さんはどうなんですか？

お節介かもしれませんが… 削除/引用 No.2224-6 - 2010/03/14 (日) 15:29:54 - ナナ 自分の周りで同じようなトラブルを抱えたヒトを参考に例を挙げてみます 問題点と解消法 ・3'-末端にA(アデニン)が付加されないPCR酵素(TaKaRaのPrimeSTARシリーズなど)を使用→PCR酵素の変更(TaKaRaのExTaqシリーズなど) ＊平滑PCR産物末端にAを付加する方法もあります。 ・PCR産物を直接使用している→泳動＆ゲル切りだしを行う ＊プライマーとPCR酵素の除去が出来ていればOK ・プラスミドと大腸菌の相性→大腸菌又はプラスミドの変更 ・大腸菌の保存が冷凍庫(-20〜30℃)などで行われている→-80℃に保存するようにする おそらく下の２つ例はごくまれにしか考えられないとおもいますので、上の２つのうちどちらかだと考えられます。

(無題) 削除/引用 No.2224-5 - 2010/03/14 (日) 11:09:20 - ｓｄｆ 絶対コンピタントセルの問題です 早くコマーシャルなものに変えれば全てうまくいきます

(無題) 削除/引用 No.2224-4 - 2010/03/14 (日) 00:03:38 - モモ 私はもう何年もＴＡクローニングをしてないので、見当違いかもしれませんが。 ポリメラーゼによってはブラントエンドになるとか。 その場合はブラントエンドのキットを使うと良いのではないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2224-3 - 2010/03/13 (土) 23:49:02 - ami > TA cloningはこれまでルーチンにやっておられたら無視してください。 ルーチンにはやってないのです。今回がDNA扱うの初めてです。ただ、ボスは、淡々とノックアウトマウスを作る勢いです。ただ、ボスは、まぁ４個出るときもあるしいいじゃないか、とか言っているのですが、０のときがあって非常に困るのです。 > amiさんのことですから、手技的なことや菌を播種する時に加熱しすぎるなどのミスはしていないと思いますので、自作のコンピかなあ。 買ったコンピとControl PlasmidではカタログどおりのEfficiencyになるので、たぶん大丈夫だと思います。ボスも確認しました。やっぱり自作のコンピなのでしょうか。キット付属のコンピは1x10^9とか書いてありました、2x10^6は低いでしょうか。その辺が、経験がないので分かりません。

(無題) 削除/引用 No.2224-2 - 2010/03/13 (土) 23:33:13 - 細胞 TA cloningはこれまでルーチンにやっておられたら無視してください。 私もよくTA cloning行います。 PCR product 2 ul (ゲルから切り出したもの) Salt 0.5 ul TA vector 0.5 ul --------------- 30 min, r.t ↓ 2 ulをDH5αにtransform ↓ X-galをひいたLA plateで＞３０のcolonyは普通に出ています。 amiさんのことですから、手技的なことや菌を播種する時に加熱しすぎるなどのミスはしていないと思いますので、自作のコンピかなあ。

TAクローニングうまくいきません 削除/引用 No.2224-1 - 2010/03/13 (土) 23:21:47 - ami お世話になっております。 InvitrogenのTOPO TA cloning kitを使用してTAクローニングをしているのですが、出てくるコロニー数が非常に少なくてなんだか困っています。 500bpくらいの短いインサートでも、キット付属のControl反応でも、出てせいぜい4つくらいで、0なこともあります。インサートはちゃんと入っているのですが、コロニー数0なこともあるのが困ってます。 市販のコンピテントセルを使って、ただのPlasmidでTransformationすると、だいたいカタログ値のコロニー数になるので、Transformationの手技は大丈夫だと思ってます。 実際のTAクローニングにはコンピテントセルは自作のケミカルのを使っていて、Efficiencyは2x10^6/ug DNAくらいです。これが問題かなぁと勝手に思っていますが、他に改善できそうな点はありますか。インサートの量はだいぶ振ってみました。

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