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(無題) 削除/引用 No.2220-12 - 2010/03/20 (土) 11:17:38 - clone みなさまありがとうございました。 1stを精製後，メーカー推奨の条件で無事結合できました。

(無題) 削除/引用 No.2220-11 - 2010/03/15 (月) 15:18:11 - clone ＞どらさん ありがとうございます。 酵素の変更ですか，手元にはKODやrocheの酵素もあるので primeSTARでうまくいかなかったときには挑戦したいと思います。 ＞774さん ありがとうございます。 一応，プロトコールはtakaraのLA mutagenesis kit と過去の double joining PCR の方法にならって設定しました。 後者の論文ではアニーリングを2分から10分としていましたが，やはり長いでしょうか？ オーバーラップする長さとアニーリングに必要な時間に相関性は無いと思うのですが， 結合できないとどうしようもないと思い2分で設定していました。 ＞エコエコさん PrimeSTARを使用されている方がいらっしゃって安心しました。 周りの研究室の先生（うちには分子系の得意な人がいないので）にはKODに変更するようにも言われました。 確かに，メーカーの推奨プロトコールで回す方が良いのかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.2220-10 - 2010/03/14 (日) 22:22:27 - エコエコ 私は1kb同士のjointしかしたことはないですが、オーバーラップ20bpで酵素はPrimeSTARを使用していました。テンプレート量は10-100ngで適当に1:1になるように合わせて。 PCR条件はPrimeSTARの説明書通りで増やせていました。 98℃・10秒->55℃・5秒->72℃・2分　×30回 テンプレート量やサイクル条件を変にいじらないで酵素の説明書通りにやるのがコツかなと思っています。

(無題) 削除/引用 No.2220-9 - 2010/03/14 (日) 13:19:08 - 774 感覚的で申し訳ありませんが、アニーリング 2分は長いように思います。 mutationの可能性がありますが、サイクル数を増やせませんか？ 僕だったらmhさんのアドバイスにと似た感じで、プライマー無しで3~5サイクル、それからプライマーを加えて20サイクルくらい回します。

(無題) 削除/引用 No.2220-8 - 2010/03/14 (日) 07:35:29 - どら 昔同じようなことをしようとしていましたが、PCR酵素によって好き嫌いがあるらしく、酵素を変えたらうまく系が走り出したことがありました。 手元にそのノートが無いのでどの酵素がよかったのか覚えておらず、情報としてあまり意味を成していませんが参考までに。

(無題) 削除/引用 No.2220-7 - 2010/03/13 (土) 18:24:26 - clone ぶんさん ありがとうございます。 2ndに持ち込む量は多い方がよいのかと思っていましたが 逆効果なのですね。 1stは泳動でバンドがはっきり見えるので 希釈して挑戦したいと思います。

(無題) 削除/引用 No.2220-6 - 2010/03/13 (土) 15:50:23 - ぶん 1stを5ulは使いすぎだと思います。 1stがどれくらい増えてるのかにもよりますが、テンプレート（プライマーも）多すぎではないでしょうか？ 1stPCRが泳動してバンドが見えるぐらいあるのでしたら 1:1で混ぜたもの1ulを1/100ぐらいに薄めて使うと良いと思います。 これでしたらプライマーの持ち込みもかなり減るのでPCR産物を精製しなくても 上手くできると思います。

(無題) 削除/引用 No.2220-5 - 2010/03/13 (土) 14:26:38 - clone 文字化けしてしまいました。 使用している１ｓｔ産物は５ulです。

(無題) 削除/引用 No.2220-4 - 2010/03/13 (土) 13:53:11 - clone ぶんさん ありがとうございます。 以前，TaKaRa LA　mutagenesis kit を使用した経験があったので それを参考にして以下のように実施しています。 PCR産物はモル比で１：１になるように 1st の反応液を 5µl 使用しました。 反応は 98℃・10秒->55℃・2分->72℃・5分　×10回　です。 酵素はPrimeSTARHSを使用しています。 mhさん ありがとうございます。 教えていただいた方法と今の方法では 1.のPCR産物の精製をやっていませんでした。 精製をやって再チャレンジしたいと思います。

３ステップ 削除/引用 No.2220-3 - 2010/03/13 (土) 08:57:12 - mh 2.5kbの長さのPCR産物同士を結合させたことはありませんが、もう少し短い1kbのPCR産物なら何度かやったことがあります。このときの重なりは30bpぐらいです。 １．PCR産物は、ゲルから切り出して精製します。スピンカラム法では、プライマーを除去しきれないことがあるのでお勧めしません。 ２．精製した2種類のPCR産物（等量）だけを混合して94℃で加熱処理した後、自然にアニーリング温度に下がるまで待ちます。その後、プライマーを除いたPCR反応液（TaqやdNTPなど）を混合し、72℃で伸長反応します。酵素にもよりますが、2.5kbなら3〜5分ぐらいで十分だと思います。これで、ステップ３の鋳型になる5kbの産物ができます。酵素は、エラーを起こしにくく、5kb以上増幅できるものを使えば大丈夫です。 ３．伸長反応が終わった反応液に、5kbを増幅させるためのプライマーセットを加えて、通常のPCRを行います。サイクルは、もとのPCR産物の量にもよりますので検討してください（25〜30 サイクルぐらい）。伸長時間は、5分ぐらいがいいのでは。 加熱後の2種類のPCR産物がアニーリングしたときの絵を描いてみると分かりやすいですよ。4種類のアニーリングパターンのうち、ステップ２で5' -> 3'に伸長反応して5kbの長さになるのは1種類だけです。 頑張ってください。

(無題) 削除/引用 No.2220-2 - 2010/03/12 (金) 20:46:04 - ぶん PCR産物同士の量は合わせましたか？ また、どれくらいに薄めてPCRしましたか？ 2回目のPCRのエクステンションタイムは長めにしましたか？ 酵素は5kbぐらいでも大丈夫な酵素ですか？

PCR産物同士の結合 削除/引用 No.2220-1 - 2010/03/12 (金) 18:31:16 - clone 現在，ある遺伝子のcDNAクローンを作製するために joint (joining) PCR をやっています。 オーバーラップする領域は60bpくらい，各PCR産物は2.5kbくらいです。 まず，初めに2つのPCR産物を鋳型に通常のPCRをしましたが，うまく結合できませんでした。 次に，PCR産物だけを94℃まで加熱して変性後，室温まで戻してからPCRをしましたが， これでもうまくいきませんでした。 皆様，このようなPCRをするときにどのようなことに気を付けていらっしゃるのでしょうか？ オーバーハングする領域が長すぎるのかな？とも思っています。

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