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あらら・・・ 削除/引用 No.222-11 - 2009/03/24 (火) 01:57:56 - Tb トピ主さん、済になってしまいましたが、感染させられる細胞とわかっていて、発現レトロベクターもパッケージング細胞も持っていて、あきらめてしまうのはもったいないですよ。レトロは恒常的発現だし、pMXsベクターはIRES-GFPがついているから入った細胞がわかってで、いいとこづくし。血球系はエレクトロボレーションでもまず入りませんし、Amaxaだって入るけどばんばん死んでしまいますので私はおすすめしません。 もし、入れたい細胞がマウスCD4+ T細胞なら、レトロ感染プロトコル、教えられますよ。

解決しました。ありがとうございました。 削除/引用 No.222-10 - 2009/03/24 (火) 01:21:23 - 発現して欲しい usbさん、再度のご投稿ありがとうございます。 ウイルスの発現原理に関する書物が見つけられていなかったので、 非常に参考になりました。大変丁寧なご回答ありがとうございました。 エレクトロポレーションによる遺伝子導入を目指して、とりあえず 手元にあるレトロのベクターが使えたら・・・と思っていたのですが、 ウイルスベクターのみでは、一過性発現はともかく恒常発現株を得るのは 難しそうだということがわかりました。 （当初、LTRを介した高効率のインテグレーションを期待していました） ウイルスベクターをそのまま使うという横着？をせず、 CAGプロモーターのベクターに載せかえをしたいと思います。 Plat-Eも難しい細胞とのこと、確かにウイルスは産生されているようなのですが、 感染効率が今一つであったのも、状態が悪くなってしまっていたせいなのかも しれません。 ご投稿くださった皆さま、おかげさまで、疑問が解決いたしました。 本当にありがとうございました。

ありがとうございます 削除/引用 No.222-9 - 2009/03/24 (火) 01:10:42 - 発現して欲しい Tbさん、ありがとうございました。 入れたい細胞は末梢の成熟細胞で、レトロで導入に成功したという報告は 多数あげられており、本来、入って当然ということなのだろうと考えております。 当方で作製したウイルスにつきまして、易導入性の細胞への感染はOK ということを確認しており、その点に大きな問題はないかと思います。 一方でご指摘の通り、感染の最適条件が見つけられていないという状況 だと思います。自分たちなりに、いろいろ改善を試みましたが、 どうやら我々の手ではうまくできないようなので、他の方法を・・・ と考えております。 ご教示ありがとうございました。

インテグラーゼはpolに含まれます 削除/引用 No.222-8 - 2009/03/24 (火) 00:23:57 - usb > 私の理解だと、上記パッケージング細胞にtransfectされているもの > （パッケージング？ベクター）には > インテグラーゼとみられる配列がないように思うのですが、 > インテグラーゼは通常、cis、transのベクターに載っているものなのでしょうか。 > （または、当たり前すぎてマップには記載されていない？） 最も単純なレトロウイルスはgag pol envの3つの遺伝子をコードしています。このうち、gag-polは一つの大きな融合タンパク質として合成され、その後proteaseによりいくつかの機能的なタンパク質へと成熟します。gag遺伝子に含まれるタンパク質は主にウイルス粒子をつくり、pol遺伝子に含まれるタンパク質は逆転写酵素やインテグラーゼなどとして機能します。 （ですので、実際ウイルスベクターを使用する際はgag-pol発現plasmidを用いていれば問題なしです。） また、パッケージング細胞はgag-polとenvが発現しているはずなので、これらの発現plasmidをtransfectionする必要はありません。 質問者様の場合ですが パッケージング細胞plat-Eをご使用とのことですので、LTRが入ったplasmidをtransfectionされれば、理論上ウイルスが産生されます。しかし、plat-Eはecotropicなenvを産生していますので、マウス由来以外の細胞には感染しません。（ラット由来は感染するかも） また、plat-Eはパッケージング細胞として非常に良い細胞ですが、少し難しい細胞でもあり、継代を重ねるとすぐにウイルス産生能力が激減すると聞いています。 　ですので、もし何度も継代をしたplat-Eをお使いの場合はストックを起こし直すことが一つの解決につながるかもしれません。 293GPを使用したVSV-G系も使用されているとのことですがこちらについては存じ上げませんので、アドバイスができません。ご容赦ください。

血球正細胞とは具体的には？ 削除/引用 No.222-7 - 2009/03/23 (月) 22:31:52 - Tb 血球系細胞とありますがどのような細胞でしょうか？ 血球系といっても分化したT, B細胞なのか、骨髄未分化細胞なのか。細胞の違いによりレトロウイルスの感染の難易度、プロモーターの不活性化の程度は異なります。 ほかのラボからはその細胞にレトロを感染させた報告はありますか？免疫分野は多くのラボがレトロウイルスを使っているので、もし報告が見あたらなければそれはその細胞には感染させられないことを意味するのかもしれません。 もしほかのラボでできているようであれば、ウイルス産生や感染の仕方の最適化が不十分であるのでしょう。

インテグラーゼはどこに載っているのでしょうか 削除/引用 No.222-6 - 2009/03/23 (月) 21:42:14 - 発現してほしい usbさん、ご投稿ありがとうございます。 １．、２．につきまして、発現するだろうとのこと、ありがとうございます。 血液系の細胞はCMVプロモーターが動きにくいようで、非常に低い発現 or 全く発現しないという事態に遭遇したことがあり、避けてきました。 CAGプロモーターは試したことがないのですが、b-actinプロモーターでは 発現経験がありますので、期待できそうです。試してみたいと思います。 ウイルスベクターの名称を打ち損じておりました。 正確には、pMXsで、パッケージング細胞はPlat-E、293GPを使用したVSV-G系などを使用しています。 > レトロウイルスにおいてLTRのみが存在していても宿主ゲノムにインテグレートされません（偶然を除く）。効率的にインテグレートされるためにはウイルスタンパク質のインテグラーゼが必要です。 私の理解だと、上記パッケージング細胞にtransfectされているもの （パッケージング？ベクター）には インテグラーゼとみられる配列がないように思うのですが、 インテグラーゼは通常、cis、transのベクターに載っているものなのでしょうか。 （または、当たり前すぎてマップには記載されていない？） > ところで、ウイルスを作製しないで実験をされるのであれば普通の発現ベクターを用いたほうが良いのではないでしょうか？ 市販のベクターは、CMVを用いている場合が多く、これまで 敬遠してきました。 CAGプロモーターのベクターを発見したので、試してみたいと思います。 > エンベロー（env）は適切なものを用いられていますか？ はい、Eco（Plat-E）もAmpho（293GP）も試し、細胞増殖自体も問題ないと 思うのですが、うまくいかないのです。 私自身では、世間でもよく言われていることのようですが、 血球系細胞の場合、 感染効率が著しく低い、あるいはプロモーターがすぐに不活化されてしまう、 ということではないかと思っています。 レンチも試してみようかと思っているのですが、 ウイルスに明るいラボではないので、レトロ以上に難しいということで、 こちらも躊躇しているところです。 いろいろとご教示いただきまして、ありがとうございます。 よろしければ、中盤の質問に関しまして、お教えいただけると嬉しく存じます。 よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.222-5 - 2009/03/23 (月) 19:26:51 - usb １，２ 発現はすると思いますが、CMVやCAGプロモーターほど大量に発現しないのではないかと思います。 ３ これは通りすがり様がご指摘されているように通常の発現プラスミドを用いてstableを作る際と同じだと思います。 レトロウイルスにおいてLTRのみが存在していても宿主ゲノムにインテグレートされません（偶然を除く）。効率的にインテグレートされるためにはウイルスタンパク質のインテグラーゼが必要です。 ところで、ウイルスを作製しないで実験をされるのであれば普通の発現ベクターを用いたほうが良いのではないでしょうか？ また、ウイルスを用いた系ではうまく発現しないとのことですが、エンベロー（env）は適切なものを用いられていますか？ MXｓというものを存じ上げないので具体的にアドバイスできないのですが、 ecotropicなenvではマウス系の細胞にしか感染できませんし、primaryのようなほとんど分裂しない細胞ではレトロウイルス系ではなくレンチウイルスベクターを使用しなければインテグレートされません。 こういった点は問題ないのでしょうか？

ウイルスベクターの発現原理 削除/引用 No.222-4 - 2009/03/23 (月) 18:11:09 - 発現してほしい 通りすがりさん、ご投稿ありがとうございました。 ご紹介いただいたサイトではありませんが、そのようなメーカーサイトで 勉強？させていただきました。 逆にいうと、当ラボには、私を含めウイルス発現系に詳しい人間がいないので、 そのようなサイトでしか勉強しておりません。 ごく基本的な質問となり申し訳ございません。 > ３ > 普通の発現ベクターでstableに発現する細胞を作るときと同じです。 ３．へのお答えから拝察いたしますと、 １．、２．への答えも「発現する」ということで良いでしょうか。 ウイルス関連分子として、gag、pol、envくらいしか知らず、、、 ウイルスベクターの発現原理がよくわかっていなくてすみません。 自己流で集めた知識なので、誤っている箇所などございましたら、 もしよろしければご教示いただけますと幸いです。 どうぞよろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.222-2 - 2009/03/23 (月) 17:01:35 - 通りすがり １、２ http://catalog.takara-bio.co.jp/product/basic_info.asp?unitid=U100003844 このようなもので勉強されましたでしょうか？ ３ 普通の発現ベクターでstableに発現する細胞を作るときと同じです。

ウイルスベクターを発現ベクターとして扱えるでしょうか？ 削除/引用 No.222-1 - 2009/03/23 (月) 15:59:53 - 発現してほしい レトロウイルスによる遺伝子導入＆発現を行っております。 血球系細胞に遺伝子導入を行いたいのですが、 ウイルスによる遺伝子導入系ではなかなかうまくいかないので、 Amaxaなどを使ったエレクトロポレーション法を試そうとしています。 ウイルスベクター関係はまったくの素人で、 お教えいただきたく投稿させていただきました。 尚、使用しているウイルスベクターバックボーンはMXsで、 3'LTR、5'LTR、ψ、目的のcDNAを搭載しております。 １． ウイルスでなく、「ウイルスベクター」のみをエレクトロポレーション等 で細胞（パッケージング細胞ではない細胞）に導入した場合、 通常の発現ベクターを導入した場合のように発現が期待できるでしょうか。 ２． ウイルスベクターのプロモーターはLTRであると聞いたのですが、 このLTRは、他のウイルス分子（gag、pol等々）がなくても 目的細胞内で発現させることが可能でしょうか。 ３． 導入したウイルスベクターが、できればゲノムにインテグレートされ、 恒常発現株となってくれることを期待しています。 ウイルスベクターは、3'、5'のLTRを介してゲノムにインテグレート されると聞きましたが、 他のウイルス分子がなくても目的細胞内でゲノムにインテグレート される可能性はありますでしょうか。 質問が重複していて申し訳ございませんが、よろしくお願いいたします。

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