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(無題) 削除/引用 No.2217-5 - 2010/03/25 (木) 18:15:47 - メタボ ＞脂肪様 御返信ありがとうございます！ 確かに、包埋前に脱脂操作をしたら、モノがなくなっちゃいますよね。 変な記述をしてしまい申し訳ありません（汗） 色々と御助言ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2217-4 - 2010/03/24 (水) 07:16:58 - 脂肪 メタボさん 手順としては、 組織摘出 ↓ 4%PFA (O/N) ↓ 10%スクロース (8-12h) ↓ 30%スクロース　(O/N) ↓ OCT Compoundで包埋 です。 薄切後のアセトン脱脂は気になるようでしたらすればいいし、場合によってはしなくてもいいと思います。 ちなみに包埋前にアセトンに漬けたら全部脱脂されて脂肪組織なくなっちゃうと思いますよ（苦笑） 脂肪組織の免染はどうしても非特異っぽい反応が多く出てしまうので、本当に染まっているのかどうなのか、判定が難しいですよね… ホルマリンで固定すれば多少ましになりますが。

(無題) 削除/引用 No.2217-3 - 2010/03/20 (土) 23:16:13 - メタボ ＞脂肪様 ご返信ありがとうございます。 ＞新鮮凍結だと切片が汚くて大変だった記憶があります。 確かに新鮮凍結した脂肪組織は形がいびつであったりゴミ（？）が多くて、他の組織と比べると汚い感じでした。 ＞4%PFAなどで固定してから包埋した方がいいと思います。 手順としては、 （組織摘出）→PFA固定→脱脂→OCTコンパンウンドに包埋 と理解して宜しいでしょうか。 現在、OCTで包埋し切片作成した後にアセトン固定（＆脱脂 10分）を行っていますが、OCT前の脱脂のステップは入れたほうがいいでしょうか。 色々と質問して申し訳ありませんが、何卒ご教授お願い致します。

(無題) 削除/引用 No.2217-2 - 2010/03/18 (木) 03:57:07 - 脂肪 4%PFAなどで固定してから包埋した方がいいと思います。 私の技術不足だったかもしれませんが、新鮮凍結だと切片が汚くて大変だった記憶があります。 どうしても新鮮凍結にこだわるなら、下記のサイトを参考になさってもいいかもしれません。 http://immuno.med.kobe-u.ac.jp/fat_frozen/fat_frozen.shtml 乳腺の切片作成方法ですが、脂肪が多くて切りにくいのは一緒ですし。

脂肪組織の免染 削除/引用 No.2217-1 - 2010/03/12 (金) 09:39:49 - メタボ 現在マウスの皮下脂肪および内臓脂肪を用いて、脂肪組織中のマクロファージの免染（蛍光抗体法）を行おうとしています。 しかし、蛍光がぼやけて見えたり、あるいはノンスペが見えたりして、はっきりとした像が見られなく困っています。 ちなみに、この抗体を用いて脂肪組織以外の臓器でマクロファージのdetectionは出来ましたので、反応性に関しては問題ないと思います。 現在、切片作成までの手順としては、 組織摘出 ↓ OCTコンパウンドに浸し、液体窒素で急冷 ↓ （切片作成 : 外部委託） ↓ cold acetone で固定 10min、風乾 （-80℃に保存) また、切片作成後の操作として、 PBS 洗浄 ↓ 5% goat serum (in PBS, 0.1% Triton X-100)で1時間、室温にてブロッキング ↓ PBS 洗浄 ↓ ブロッキング液で抗体 (alexa488 anti mouse CD68)を希釈し、切片に滴下。 暗所にて1時間静置。 ↓ PBS 洗浄 ↓ 封入、観察 です。 像がぼやけてしまう原因が良く分かりません。 脂肪組織の脂質含有量が多いせいなのかとも思いますが、上記プロトコルにありますように、アセトンで脱脂操作（および固定）を行っています。 アセトン以外にも、キシレン/メタノール等で脱脂するステップを入れた方が良いでしょうか。 脂肪組織の凍結切片（あるいはパラフィン切片でも結構です）で免染（蛍光抗体法）を行っている方がいらっしゃったら、ぜひご教授お願い致します。

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