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(無題) 削除/引用 No.2212-6 - 2010/03/17 (水) 17:43:58 - Kanata 門外漢の的外れな質問になるかもしれませんが、 ＞ある細胞表面の受容体が、薬剤Aによりshedding されたり、発現がdown ＞regulationされるのではないかと考え実験しています。 薬剤によるSheddingを見るのに、homogenizeしてELISAでも検出できるのでしょうか？確かにFACSは使える部署、使えない部署があるので限界がありますね。 お尋ねの ”浮遊細胞系の実験について詳しく書かれてある書籍” ですが、私自身は細胞培養に関する書籍で取り扱い方に慣れてから、それぞれの分野の教科書的なもの(Methods in Enzymology やJournal of Immunological Methodなどなど）を参考にしているので、培養細胞系実験の書籍があるかどうかわかりません。 すでにお持ちかとは思いますが、ごく基本の細胞培養に関する書籍を代わりにあげます。個人によって好みがあるので、書店で手にとってみてください。 ・バイオ実験イラストレイテッド　第6巻　すくすく育て細胞培養（学研メディカル秀潤社） ・細胞培養入門ノート（羊土社） ・培養細胞実験ハンドブック（羊土社）

(無題) 削除/引用 No.2212-5 - 2010/03/15 (月) 12:07:03 - hiro Kanata さん 　ご指導ありがとうございます。本当に勉強不足ですいません。 １．incubationはCo2 incubatorの中で行ってました。しかもmicro tubeのふ 　　たをして。ご指摘の通り、これは良くないですね。 ２．実験によるロスの可能性が高いと考えます。 　　ある細胞表面の受容体が、薬剤Aによりshedding されたり、発現がdown regulationされるのではないかと考え実験しています。incubation後に 　　死ぬのはいいかなと思いますが、incubation中に死んでいる可能性があ 　　り、再検討してみます。 ３．FACSは当施設では不可能です。 　もしよろしければ、浮遊細胞系の実験について詳しく書かれてある書籍をご存じなら教えていただきたいのですか、よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.2212-4 - 2010/03/15 (月) 11:23:13 - Kanata hiroさん 質問と回答が一致していないので、補足の形で書きます。 もう一度私の質問に答えていただけませんか。 > １．12-well plateでincubationを行うと上清をpick upする際に行う遠心はどうやって行うのですか？　僕らは後で遠心を行えるようにmicro tube で薬剤投与、incubationを行ってました。 インキュベーションはCO2インキュベーター内で行っていますか？（これが質問の一つです）plateを用いてインキュベートした場合、(12-wellは例です。ボリュームにあわせて変えます）、インキュベート終了後、各ウェルをエッペンドルフチューブなどに回収してから遠心します。 　hiroさんのやりかたでは、micro tubeの蓋を密閉しているのですか？そうであればair（というかCO2)を取り込めず、そのこと自体が実験に影響を及ぼす可能性があります。培地の色が通常と変わっていないでしょうか。 　もしも37℃のWater Bathによるインキュベーションだったら話は別ですが。 2．私の質問は、１X10^5/mlという細胞数は、培養がうまくいっていないということなのか、実験によるロスなのかということです。仮に実験によるロスだとすると、1での実験で細胞が死んでいるから回収率が下がっている可能性があるのではないでしょうか。（見てみないとわかりませんが）死細胞は遠心後、上清に行きます。 細胞を回収する場合に回転数をあげるのはお勧めしません。細胞にダメージがあるからです。蛋白量の補正をする前に、１．の実験が妥当であるか確認してはどうかと思います。 > 3. 1公立病院のラボなので、現実的には自分たちで行っていくしかない状況です。友達の大学病院の同級生とかに聞いていますが、なかなかで、本 サイトに質問させていただいております。 私の質問はELISAではなくFACSでの表面受容体の測定は可能なのかどうかということです。 　失礼ながら、これらの回答を拝見する限り基本的な細胞培養や実験手技にあまり慣れていらっしゃらないように感じられます。その場合、基本的な教科書を熟読するか、詳しい方に実際に見てもらうことが一番効果的です。私の質問とhiroさんの回答がかみ合っていないように、Webでの質問と回答は限界があるものです。 　ちなみに、羊土社から初心者むけの基本実験書（イラストが多用されている）が出版されているので、そういったものを利用するのも一つだと思います。

THP-1 削除/引用 No.2212-3 - 2010/03/15 (月) 08:41:37 - hiro 早速のお返事ありがとうございます。 基本的なことで本当にもうしわけありません。 １．12-well plateでincubationを行うと上清をpick upする際に行う遠心は 　　どうやって行うのですか？　僕らは後で遠心を行えるようにmicro tube 　　で薬剤投与、incubationを行ってました。 2. 細胞表面の受容体をELISAにて測定しようとする場合に、PBSによるwash その後lysis bufferによる細胞融解が行程にあるのですが、washはPBSで 　　洗浄後、遠心して、マイクロピペットでPBSを吸引する方法をとっている 　　のですが、遠心して、回転数を上げても細胞自体を吸引してしまって、 　　細胞数が少なくなったり、各検体間の均一性が保てなくなります。BCA法 　　でタンパク量を測定し、補正しているのですが、この方法でいいのかコ 　　メントいただけないでしょうか？もしくはもっっと良い方法はご存じ内 　　でしょうか？ 3. 1公立病院のラボなので、現実的には自分たちで行っていくしかない状況 　　です。友達の大学病院の同級生とかに聞いていますが、なかなかで、本 　　サイトに質問させていただいております。 　どうぞよろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.2212-2 - 2010/03/11 (木) 18:45:53 - Kanata hiroさんの実験系を勘違いしていたらすみません。 １．1.5ml microtubeでインキュベートするのは何か特別な意図があるのでしょうか。（文面からmicrotubeでインキュベートしているかのように取れてしまいましたが） 　よく用いるのは（細胞数によりけりですが）12-well plateなどを用いてCO２インキュベーター内でのインキュベーションですが・・・。 ２．細胞数が1 x 10^5個/mlぐらいだったというのは、実験開始のときの細胞数より減ったということですか？？それとも継代してもその数だったということですか。 ３．本題ですが、細胞表面の受容体の測定はFACSではできないものでしょうか。（濃度測定ではありませんし、装置の使用が可能でないかもしれませんが） 同じラボでなくても、近くのラボの方などに意見を聞くことはできませんか？ 細胞の継代などは実際に見たほうがアドバイスしやすいので、掲示板よりも直接話をできる環境のほうがよいかと思います。

THP-1のELISAについて 削除/引用 No.2212-1 - 2010/03/11 (木) 18:15:10 - hiro いつも勉強させていただいております。 実験の初心者で、基本的なことを質問させていただきたいのですが、現在までは大動脈内皮細胞などの接着細胞を使用していたのですが、今回THP-1での実験を始めようとしております。やっと、継代培養まで行えるようになったのですが、THP-1の上澄み、Lysis bufferでとかした細胞表面の受容体の濃度をELISAにて測定使用としているのですが、感度以下で測定できません。方法論に問題があるのでしょうか？ 　1. 25cm2のフラスコ数個をまとめて遠心し、上清を吸引。 　2. 数mlのRPMI1640を混ぜて、細胞浮遊液を作成し、細胞数をcount 3. 1.5ml micro tubeにmedium, medium＋drugなどを入れ、その後細胞浮遊 　　液を均等に播種。 　4. 数時間後にmediumをpick up 細胞数は1.0×106/mlを目標にしていたのですが、1.0×105個くらいにしかなりませんでした。 Bossと僕と、実験助手さんの３人のlaboのため、なかなか聞ける方がいなく 些細なことでかまいませんので、ご教授いただけると幸いです。

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