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もう解決しました？ 削除/引用 No.221-15 - 2009/03/27 (金) 01:12:29 - zuum meさんの方法を読んでいて思ったんですが、 PCR 産物はシングルバンドでしょうか？ ノンスペだとか、プライマーダイマーとかはありませんか？ 僕は良く PCR 産物をアガロースゲルで分離 & 精製したのち、 適当なプラスミドの MCS へ平滑末端でライゲーションさせます。 いままでこの方法で、10kb くらいまでなら問題なくクローニングできてます。 普通のPCR 産物の末端にはリン酸基がないので、ライゲーションの際に インサート : ベクター比を 100-1000 : 1 にするとよいです。

沢山のsuggestionを頂き、有難うございました。 削除/引用 No.221-14 - 2009/03/24 (火) 11:56:32 - me 皆様、色々教えて頂き、本当に有難うございます。 (先程、間違って送信していまいました。すみません。） 当ラボの標準がinvitrogenのT-vector(pCRII-TOPO)でしたので、KOD plus産物を精製した後, rTaqでAを付加する方法をとりました。 ats様、~様にご提案頂いたInvitrogenのPCR Zero blunt TOPOについては何となく知っている程度でした。blunt ligationは頻度が低そうという意識もあったのですが、かなり長いフラグメントでも入るとのご経験談を伺いましたので、当方も検討してみようと思います。 genji様、DNAI様にご提案頂いた、TArget Clone-Plus-(A-attachment mix)も良さそうですね。 Pumpkin様、AP様、KODの性質を考えれば、A付加の前にきちんとした精製が必要なのは至極当然の事ですね。ご助言有難うございました。 皆さんのご経験・ご意見を頂き、4kb超のフラグメントのTA-cloningが、すぐにあきらめてしまうほど難しいものでは無いと分かりました。改善を加えてもう少し頑張ってみようと思います。 このようなweb siteに投稿するのは初めてでしたが、短時間で多くの皆様の助言を頂き、とても驚いております。改めて感謝申し上げます。

沢山のsuggestion, 削除/引用 No.221-13 - 2009/03/24 (火) 11:32:30 - me

(無題) 削除/引用 No.221-12 - 2009/03/23 (月) 18:54:09 - ~ atsさんのおっしゃる通り、どうせTOPOでやるんであれば、同じInvitrogenのPCR Zero blunt TOPOを使ったほうがいいように思うのですが、、、わざわざAを付加する必要もないし、これだとccdBが組み込んであるので、断片が挿入されなかったものは生えてきません。

(無題) 削除/引用 No.221-11 - 2009/03/23 (月) 16:57:52 - DNAI 最近はもっぱらKOD plusで増やし、TArget clone plusでTA cloningをやってます。 長いフラグメント（3kbp以上）は確かに効率が落ちますが、白コロニー4つ程度拾って問題なくサブクローニングできています。

(無題) 削除/引用 No.221-10 - 2009/03/23 (月) 16:49:30 - AP >PCR産物を制限酵素で切る際、その前にカラム等で精製した方が宜しいでしょうか。それともエタ沈でバッファー置換するので十分でしょうか？ カラム精製か、フェノール抽出した方が良いと思います。 耐熱性polはエタノール沈殿では完全な失活が保証されずdNTPも残存するので、制限酵素切断後の突出末端をfill-inしたり、polish-upしてしまう可能性があります。 同じように、KOD PCRのあとは十分な精製がなされているでしょうか。KODが残存していると、Taqで付加されたA突出を削ってしまう可能性があります。 また、校正活性のある酵素でPCRしたあと、直ちに精製しないと末端の削り込みがおこる可能性があります。Blunt endにそろわないばかりか、末端の制限酵素消化も出来なくなってしまいます。

(無題) 削除/引用 No.221-9 - 2009/03/23 (月) 16:45:13 - Pumpkin できれば、是非実験書や参考書をお読みになっていただくのが良いかと思います。 制限酵素で消化してライゲーションするにはどのようにすればよいのかという、至極基本的なことです。私はステップ、ステップでしっかりと精製する方です。その方が、色々な反応の効率が上がると思います。

皆さんご意見有難うございます。 削除/引用 No.221-8 - 2009/03/23 (月) 16:38:12 - me 皆様、早速ご意見いただき、ありがとうございます。 AP様、Pumpkin様、KOD plusの産物はrTaqでAを付加してからT-ベクターにクローニングしています。説明が不十分でした。申し訳ございません。 折角4kb超の全長が伸びますので、2-3個のフラグメントをつなぎ合わせるよりは、primerを作り直して(2)の方法を試しつつ(私は経験がありませんが...)、TA-cloningの方も平行して頑張ってみようかと考えております。 Pumpkin様（＆その他の方々)、もう一つ質問させて下さい。 PCR産物を制限酵素で切る際、その前にカラム等で精製した方が宜しいでしょうか。それともエタ沈でバッファー置換するので十分でしょうか？ 教えて頂けないでしょうか。宜しくお願い申し上げます。

TOPO? 削除/引用 No.221-7 - 2009/03/23 (月) 16:29:30 - ats インビトロジェン社のTOPOクローニング用ベクター(末端にTOPOタンパクが結合している切断済みベクター、ligase不要）では？ TAクローニング用とblunt endクローニング用（KODplusなどのPCR酵素用）の2種が販売されていたと思いますが、間違えていませんか？ blunt end TOPOを利用して9kbのゲノム由来PCR断片をクローニングしたことがありますよ。

(無題) 削除/引用 No.221-6 - 2009/03/23 (月) 16:23:39 - genji みなさんがsuggestionしている通り、KODを使うとblunt endになりますので、TA cloningする際には基本的にdA付加反応が必要となります。 4Kb、十分にcloning可能です。 APさんがおっしゃられている方法が一番近道だと思います。 私はTOYOBOのTArget Clone-Plus-を使っています。 このキットの中のA-attachment mixなかなかよいですよ。 今は別売りしているみたいですね。 http://www.toyobo.co.jp/seihin/xr/lifescience/products/product/idenshi/archives/2006/09/target_clonetm_target_clonetmp.html ついでに言いますと、white colonyをいくつか拾ってdirect PCRでtargetをscreeningしてからmini prepした方が、私個人としては効率がよいと思っています。

(無題) 削除/引用 No.221-5 - 2009/03/23 (月) 16:10:44 - Pumpkin 確かに、AP様の言われる通りだと思います。。。 今回はKOD plusにしたから入らなかったということはありませんか？ 入りにくいとはいっても「生えてきた数少ない白コロニー」というところに答えがあるような。

(無題) 削除/引用 No.221-4 - 2009/03/23 (月) 15:56:18 - AP TAクローニングですから、PCR産物の両端が一塩基のA突出になっていないといけないはずですね。一般的にKODのような校正活性のある酵素だと、対合していない3'末端は削られてしまうのでbluntになっているはずで、TAクローニングには不適当でしょう。いままでそれでうまくいっていたというなら、たまたまbluntにならなかったやつが低い頻度で入ったのが取れていたんじゃないですか。 その産物を精製後、さらにTaqで処理して（サイクルにかける必要はありません。72℃で10分とか）Aを付加したらいいんじゃないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.221-3 - 2009/03/23 (月) 15:54:00 - ~ 既にプライマーがあるのでしたら、私なら pGEM-TeasyII で頑張ります。 プライマーを発注しなおすのでしたら、 末端に制限酵素サイトをつけるのとともに、 1kbくらいずつクローニングできるように、中にもプライマーを設計し、発注します。 クローニング後にシークエンスを読みますよね。 そのときに、ダイターミネーター法であればプライマーを流用できます。

(無題) 削除/引用 No.221-2 - 2009/03/23 (月) 14:31:38 - Pumpkin 私なら最初から(2)の選択肢で進めます。 ご推察の通り、長いDNA断片はTAｸﾛｰﾆﾝｸﾞしにくくなりますので、4kbでしたら制限酵素サイトを付加してクローニングします。

長いcDNAのクローニング 削除/引用 No.221-1 - 2009/03/23 (月) 14:26:34 - me 4kb超のcDNAをクローニングし、発現ベクターに組み込みたいと考えています。幸いcDNAライブラリーをテンプレートにしてKOD plusで完全長が伸びたので, pCRII-TOPOというベクターに何度かTAクローニングしたのですが、生えてきた数少ない白コロニーをmini-prepしてもインサートが入っていません。 いつも1-2kbのフラグメントをTA-cloningする際は普通に上手く行っていますので、4kb超の長さが入りにくい要因だと思っております。 (1) インサートの量を可能な限り増やし、数をこなす。 (2) PCR primerの両端に制限酵素サイトを付け、PCR産物を制限酵素で切ってから目的の発現ベクターへ直接サブクローニングする。 今のところ上記の２つの方法を試してみようと考えていますが、皆さんならどの様な方法で上手く行っているのか、教えて頂けないでしょうか。 よろしくお願い致します。

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