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(無題) 削除/引用 No.2206-12 - 2010/03/15 (月) 16:58:31 - Pumpkin いろいろと検証と確認を行ったうえで、最適化されたプロトコルでやっておられるようなので、大丈夫ではないでしょうか。 時々、スタンダードカーブを取らないで、「25サイクルで比較する」とか、何の根拠もない数値設定をする方もいるのが現実です。QRTPCRが汎用に使われるようになって、深く考えずに実験が行われているのも現状かと思います。 QPCRにおけるMIQEガイドラインが昨年提唱されて、それに沿っていこうということだと思いますので一度目を通されてはいかがでしょうか（既にご一読された後であれば、ご容赦ください）。BioRadのテクニカルノートに概説も出ていたと思います。

(無題) 削除/引用 No.2206-11 - 2010/03/15 (月) 10:39:41 - 同じような ＞（独立して抽出した）各サンプルでスタンダードカーブを一度は描かないのですか？つまりはどれかを代表して描いて他のサンプルも「同じスタンダードカーブを描くに違いない」と思い込んで実験をしているということでしょうか。 お返事ありがとうございます．私はターゲットの測定とハウスキーピングの測定について，それぞれ同日に調整した同じ試薬で行っています．毎回スタンダードを引いていたのですが，値も大きくぶれないので，Diceのソフト上で検量線の傾きを（マニュアルで）代入していました．毎回スタンダードを引くのは大事なのでしょうが，測定サンプル数の関係もあり，最近は1日1回スタンダードカーブを引いて，その後はサンプルのみでrealtimeを行っています．測定は絶対定量で行っており，スタンダードカーブ作成に用いているのは，ターゲット遺伝子を増幅させてDNA量と塩基数からコピー数を計算したスタンダード液の希釈系列です．

(無題) 削除/引用 No.2206-10 - 2010/03/15 (月) 10:11:05 - Pumpkin 同じようなさんの実験手技としては、数値をお聞きする限りは問題ないのでしょうね。ただ、 >各サンプル？での増幅効率を計算する必要があるのですか？ の質問の意図が良く分からないのですが、（独立して抽出した）各サンプルでスタンダードカーブを一度は描かないのですか？つまりはどれかを代表して描いて他のサンプルも「同じスタンダードカーブを描くに違いない」と思い込んで実験をしているということでしょうか。 そうでなくて、どこまで厳密にやるかとか、この実験にはどこまで必要かとかは実験デザイン上での取捨選択で行っておられれば、それは正当かもしれません。ただ、スタンダードカーブを描いておけば、そもそも直線性のあるところで計っているのかとか、比較できるのかとか、後で問題が生じたときに検証が行えるために重要だと考えます。 >自分では信頼してよいと思っていたのですが，問題があるのでしょうか． まず、信頼してよいとおもった根拠がしっかりしていればよいのではないですか？PCが算出する数値を手計算できますか？できなければ計算の意味を理解していないので、それは信頼できるとはいえないでしょう。いかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2206-9 - 2010/03/15 (月) 09:57:14 - 同じような 検量線の傾きから計算した増幅効率は102%です（検量線の相関係数も0.99）です．ちなみに測定はDiceのソフトが統計処理まで行ってくれるので，CP法もSDM法での結果も出てきます．Diceが検量線を引いて，effも100%前後，相関係数もほぼ1で，CP法/SDM法による値のぶれもあまりありません．自分では信頼してよいと思っていたのですが，問題があるのでしょうか．判断がつきません．

同様の状況 削除/引用 No.2206-8 - 2010/03/15 (月) 09:44:36 - 同じような 私も同様の状況なのですが， TAKARAのDiceを使用しています． Eff=100%前後の表示があり， Cross point法でもSDM法でも測定結果にブレはなさそうです． 各サンプル？での増幅効率を計算する必要があるのですか？ 周りでやっている人間がいないので， このスレッドを見て心配になりました． ちなみに，スタンダードとサンプルの傾きはほとんど差はないようです．

(無題) 削除/引用 No.2206-7 - 2010/03/13 (土) 20:01:52 - Taq 増幅効率は１サイクルあたりどれだけ鋳型を増やせるかを表す値です。２倍であれば100%ですし、まったく増えない場合は０です。一般的には1サイクルあたり1.8倍以上の増加が好ましいとされています。検量線の傾きからも計算できます。計算法やソフトはWebを検索すれば出てくると思います。

(無題) 削除/引用 No.2206-6 - 2010/03/13 (土) 00:02:29 - Pumpkin >増幅効率が同じとはどのような状態 スタンダードカーブを描くときに、増幅効率を求めていないのですか？

(無題) 削除/引用 No.2206-5 - 2010/03/12 (金) 20:23:05 - 駆け出し >究極的には操作ごとに内部標準の検量線は引くべきと思います。例えば「希釈は絶対正確か」という疑問に答えられないし、そんなわけないと思います。ただ、一度実験されてみてworkする系だという確証が得られれば、毎回取りなおさなくてもいけないというようにも思えませんが。 絶対正確か？といわれれば、苦しいですが・・・ 試薬の使用量も考えると、結構馬鹿になりませんよね。そのため、同じ日に、同じMixでやる場合には、検量線を引くのは一回のみにしています。ちなみに検量線の再現性は確認済みで、ズレはほとんどありませんがいかがでしょうか。 >しかし、10倍濃いというcDNAテンプレートを使ってもたかだか10倍ですが、それで見られるようになるのですか？そもそも、その遺伝子が検出できるかを見るために希釈系列を使って検出を確認していないのですか？直線性がないところで計っても何の意味もないですよ。 実際のサンプルで、測定した際に増幅は始まっているけれども、定量（数値化）できないものがあったのを確認しています．5-10倍の濃度であれば、少なくともこれらのサンプルは計測可能（数値化できるという意味で）になるのではないかという考えです。サイクル数では3-4サイクル分稼げるのではないかという計算です。 >GAPDHとターゲットの遺伝子の増幅効率が同じであることを、予備実験で確認すれば、検量線を引かなくても計測できます。 すみません。私の知識不足で、上記の内容がいまいち理解ができません。増幅効率が同じとはどのような状態をいうのでしょうか？？

比較Ct法 削除/引用 No.2206-4 - 2010/03/11 (木) 12:34:14 - Taq GAPDHとターゲットの遺伝子の増幅効率が同じであることを、予備実験で確認すれば、検量線を引かなくても計測できます。ターゲットの遺伝子の発現が多い組織や細胞を使い、それぞれのプライマーでの増幅効率を少なくとも数回は調べましょう。PCR条件を最適化し、コントロールとターゲットの増幅効率を100%に近づけられればベストですが、増幅効率がそろわなければはRESTというソフトがありますので、蓄積された増幅効率のデータを使い、検量線なしの実験も可能です。

(無題) 削除/引用 No.2206-3 - 2010/03/11 (木) 10:13:43 - Pumpkin 究極的には操作ごとに内部標準の検量線は引くべきと思います。例えば「希釈は絶対正確か」という疑問に答えられないし、そんなわけないと思います。ただ、一度実験されてみてworkする系だという確証が得られれば、毎回取りなおさなくてもいけないというようにも思えませんが。 しかし、10倍濃いというcDNAテンプレートを使ってもたかだか10倍ですが、それで見られるようになるのですか？そもそも、その遺伝子が検出できるかを見るために希釈系列を使って検出を確認していないのですか？直線性がないところで計っても何の意味もないですよ。

(無題) 削除/引用 No.2206-2 - 2010/03/11 (木) 10:03:43 - 駆け出し ちなみにサンプルを希釈しないといけないのは， サンプルが極少のためです・・

RealtimePCRのテンプレートの濃度について 削除/引用 No.2206-1 - 2010/03/10 (水) 17:30:07 - 駆け出し RealtimePCRのテンプレートとなるcDNAの濃度について質問です。 あるターゲット遺伝子を定量，できるだけ数値化したいと考えています。 しかしながら，発現量が少ないため，定量ができないサンプルがあります。 全てGAPDHの定量は行えているサンプルなので， 発現量が少ないということは現時点でも言えるはずですが， できるだけ数値化して組織間の発現量を比較したいのです。 そこで，cDNAの量を増やして（5−10倍程度）測定してみようと思っています． 質問なのですが，各ターゲット毎にcDNAの濃度を変えた場合， 内部標準で用いるGAPDHも測定し直さないといけないのでしょうか？？ 具体的には， 遺伝子Aではテンプレート原液の5倍希釈で定量可能と思われる。 遺伝子Bではテンプレート原液の2倍希釈で定量可能と思われる。 （ちなみにGAPDHはテンプレート原液の10倍希釈で定量済みです。） この状況で，遺伝子AとBのテンプレート希釈濃度に合わせて， GAPDHをそれぞれ計り直さないといけないのでしょうか？ ちなみに，サンプル間のmRNAの濃度を揃えてからRTを行いcDNAを作成しています。 いろいろ考えすぎてわかりません。よろしくお願いいたします。

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