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(無題) 削除/引用 No.2195-9 - 2010/03/10 (水) 11:57:06 - P 深く考えないで素朴に書いています。 血液を多く含んでいそうな肝臓とかでも、私は凍結して問題があると思ったことがありません。 凍結の条件とかによるというのはありますが、それが良ければ大丈夫なのではないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2195-8 - 2010/03/09 (火) 17:10:20 - AC ;さん。ぼくとしては、そのつもりで、もし経験ある方がいれば、そうでなくてもご意見があればと思いお訊ねしたのですが、質問の仕方が悪かったようです。申し訳ありません。

(無題) 削除/引用 No.2195-7 - 2010/03/09 (火) 17:05:46 - ； それなら、最初から赤血球の凍結融解がRNA抽出に影響するか？って聞けばいいのでは？

(無題) 削除/引用 No.2195-6 - 2010/03/09 (火) 14:06:25 - AC 　APさん、うさん、ご返答ありがとうございます。 >どうして組織は凍結して大丈夫なのに、血液はダメって決めつけるのか私にはわかりません。 　確かに、凍結された組織切片などでは、Trizolを加えてRNA抽出というのはよく行われていることだと認識しています。ただ、全血は、組織やPBMCと違って赤血球と網状赤血球を多量に含んでいて、実に全血のmRNAの大半は、グロビン由来の転写産物と言われています。同じヒトからの全血サンプルと、赤血球を除去したPBMCとでは発現プロファイルがまるで異なるというのを経験しているので凍結・解凍による影響はどうなのかという疑問がありました。現時点で、ヒト凍結全血からTrizolでRNA抽出→リアルタイムRT-PCRという文献を探しきれてないので、あまりうまく行かないのかなというのもありまして。 　ひとつ、Trizolではありませんが、興味深い論文がありました。 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19028589 全血解凍後に、PAXgene RNA tubeでの安定化、その後、カラムキットでRNA抽出という流れで、マイクロアレイにも使えるというものです。解凍手順はon iceで2-h、その後PAXgene RNA tubeに移し変えなので、ここをTrizolに置換しても行ける気がします。 　いずれにせよ、preliminaryに、全血サンプルを用意して、それを通常Trizol LS処理したものと凍結解凍後にTrizol(LS)処理したものとで、見たい遺伝子の発現プロファイルが、どれほど変わるのかという確認作業が必要ですね。

(無題) 削除/引用 No.2195-5 - 2010/03/09 (火) 12:52:40 - う 凍結時の条件と、その後の保存によるところが大きいので、 それを言い出したらやってみなくてはわからないので、言及しません。 ただ、考えてほしい。 組織は凍結して保存しておき、後日RNAを抽出するということは一般的に行なわれていることではないか？ 私だったら、そこから考え、AP様のようにやります。 どうして組織は凍結して大丈夫なのに、血液はダメって決めつけるのか私にはわかりません。 あくまで、凍結時の条件と、その後の保存によるところが大きいのではないかと。

(無題) 削除/引用 No.2195-4 - 2010/03/09 (火) 11:12:08 - AP RNAlaterなんて、液体窒素やディープフリーザでの保存を必要としないということを売りにして、つい最近でてきた新参者です。RNA抽出用のサンプルはディープフリーザーで保存するというほうが、歴史的にも実績的にも重みがあると思いますが。 もちろん、凍結の条件（瞬間か緩慢か）とか保存期間の長さや温度の安定性、容器の状態などで保存状態に差はあるでしょうけれど、凍結サンプルだからだめと決めつける理由はないです。 凍結サンプルの場合、あるいは液体窒素で粉末にしたサンプルの場合、凍結状態のままTrizolを加えます。やり方によってはTrizolも固化してしまいますが、とにかく溶解と同時に混和するようにします。そのために、サンプルは大きなかたまりでなく、あらかじめ断片化、破砕、粉末化などしておくのが肝心です。

(無題) 削除/引用 No.2195-3 - 2010/03/09 (火) 01:27:29 - AC -さん、ありがとうございます。書き忘れましたが、解凍後はTRIzol LSでの抽出を想定しています。カラムキットはサンプル数が多いと高くつく印象があるので専らトリゾールを使用しています。でもそのキットで凍結全血からでも抽出できたようなので参考になりました。製品サイトを見ると、RNAはFrom 200 bases up to 35 kb.とあるので増幅サイズ150bp前後の系ではどうかなというのはあります。

全血用RNA extraction kit 削除/引用 No.2195-2 - 2010/03/09 (火) 00:51:29 - - Zymo ResearchのWhole-Blood RNA mini Prepというキットを使って 凍結血液からRNAを抽出した事があります。 凍結、非凍結サンプルを厳密に比較した事はありませんが、 凍結サンプルからも特に問題なくRNAを抽出することができました。 比較的長めのcDNAもPCRで増幅する事ができたので、 融解の段階で激しくRNAが分解はしていなそうです。 抽出時に注意したのは、サンプルが溶けかかった時にすぐlysis bufferを 加えたという点ぐらいでしょうか。

凍結全血サンプルからのRNA抽出 削除/引用 No.2195-1 - 2010/03/09 (火) 00:31:34 - AC こんにちは。上記タイトルなんですが、うちのボスが、EDTA加凍結全血バンク(-70℃保存)があるんだけど、これってリアルタイムRT-PCR(SYBR Greenを用いた系)に使えないか？と訊ねてきました。ぼくとしては、何も処理していない凍結サンプルからのRNA抽出(リアルタイムに使えそうな)はちょっと無理があるんじゃないかと思うのですが。解凍時に細胞が壊れてRNAもRNAseも出てきて、大きくダメージを受けるでしょうし。RNAlater(R)などの処理をしていればやりようがあるように思いますが。どなたかご意見をお待ちしてます。 Google Scholarで調べた感じでは、これといったものはなさそうでした。

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