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(無題) 削除/引用 No.2182-6 - 2010/03/13 (土) 05:00:14 - オハイオ 情報を頂きありがとうございます。 先日よりレファレンスのsnoRNA202といくつかのmiRNAの組み合わせで、RTプライマーを混ぜてやってみましたが、個別のチューブを用いた結果と同様の結果が問題なく得られました。検出が2種のときは水で調節できますが、3種類以上を検出する際は、等量のプライマーを混合して水を蒸発させてRTプライマーの濃度を合わせました。今後も組み合わせに注意してやってみます。 とある知人は18SのRTプライマーを自前で用意してTaqMan miRNA assayと組み合わせてやっていますが、プライマーが結合する温度が違うからとかでRTの際に温度にちょっと工夫をしているようでした。

(無題) 削除/引用 No.2182-5 - 2010/03/12 (金) 18:19:20 - vet_pooh_sun TaqMan MicroRNA Assaysを使用して実験している者です。 ABIの説明会の時にこのような事を実際に聞いてみましたが， 答えは「上手くいく組み合わせと上手くいかない組み合わせがあるのでおすすめしない」という感じでした。 Humanなら今はMultiplex RT for TaqMan® MicroRNA Assaysというのがあり，これだと組み合わせは決まっていますが，同時に逆転写できるようですので，検討されてもいいのかと思います。

(無題) 削除/引用 No.2182-4 - 2010/03/08 (月) 10:03:33 - けい >let-7 familyの検出を見る限り特異性も問題なさそうな気がしますが ものによって特異性が違うので購入するときには注意した方が良いと思います。

(無題) 削除/引用 No.2182-3 - 2010/03/08 (月) 08:54:20 - オハイオ 情報をありがとうございました。Qiagenのサイトをチェックしてみました。mRNAも含めてRTできて便利そうですし、let-7 familyの検出を見る限り特異性も問題なさそうな気がしますが、stem loop primerのものと比較された方はいらっしゃいますか？ボスをconvinceできたら使ってみたいと思いますが。

(無題) 削除/引用 No.2182-2 - 2010/03/07 (日) 18:10:04 - けい Qiagenの製品ですとRTまで一本のチューブで行えます。 特異性はTaqManの方が高いと思いますが。

microRNAの定量PCR 削除/引用 No.2182-1 - 2010/03/07 (日) 02:03:26 - オハイオ こんにちは。 今回マウス肝細胞におけるmicroRNAの発現を定量PCRで測定するためApplied Biosystems社のready-madeのTaqMan primer, probe setを購入して施行しつつあります。リーズナブルな結果が得られてはいるのですが、プロトコールどおりだと個々のmiRNAに特異的なRT用の primerを用いるため、cDNA合成の段階から個々のmiRNAとreference のsmall RNAそれぞれにチューブを用意する必要があり、労力が大きく、テクニカルな誤差の影響も大きいのではというのが率直な印象です。皆さんに質問ですが、miRNAおよびreference のsmall RNAに特異的なRT用のprimerをミックスしてone tubeでcDNA合成をし、続いてTaqMan PCRをするということを行ったことがある方はいらっしゃいますか？miRNAのTaqManをやっている知り合いの数人に聞いたところ、いずれも“workしそうだけどやったことがない”とのことでした。試したことのある方、あるいはmiRNA定量PCRに関してその他の効率的な工夫をされている方がいらっしゃったらTaqManに限らずぜひご回答よろしくお願いいたします。

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