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固定時間 削除/引用 No.2174-11 - 2010/03/11 (木) 14:47:46 - SVZ 4% PFAの固定時間は重要だとおもいます。 経験上、固定しすぎると、蛍光が弱くなります。 わたしのラボだけでなく研究所の人ともディスカッションすることがあるのですが、 固定時間は短めです。 GFPの抗体で染色するのが一番です。 MBLの抗体がいいです。 少量ですがサンプルもくれるのでためしてみては？

(無題) 削除/引用 No.2174-10 - 2010/03/08 (月) 18:07:44 - CJ ビブラトームを使う場合は抗体の浸透が常に問題になります。みみさんのおっしゃるとおり、生きている動物でなければＧＦＰ抗体で免疫染色することによってシグナルを増感でき、ＧＦＰ蛍光だけでは見えなかったものも見えてくるようになります。免疫染色を考える際にはビブラトーム切片は第１選択肢ではないでしょう。 逆に２ホトンなどを主に使うことを考えるなら、ビブラトーム切片をなんとか使うことを考えることになると思います。この場合は免疫染色時にいろいろ工夫をする必要があります。

(無題) 削除/引用 No.2174-9 - 2010/03/07 (日) 14:24:49 - 通りすがり >Vibratomeで切片を作成する場合、凍結ではなく、パラフィンや新鮮切片ということになるのでしょうか？ 　こういった質問をされるということは、Vibratomeがラボにないのかもしれないですね。Vibratomeでは、組織を固定後、PBSなどでのRinseを経て、そのまま切片を切ります。アガロースに包埋することもありますが、何も支持体を使わずに切れるのが特徴です。しかし、その分、切片が厚くなる（５０um以上)のが欠点でした。しかし、昨今は、共焦点顕微鏡が当たり前の時代ですから、この欠点が気にならくなったのです。凍らせたり、（パラフィン包埋のように）熱や有機溶媒にさらされることがないので、抗原性は高く保持されます。GFPも同様に痛みにくいと思います。 　Vibratomeは免疫電顕をするラボには絶対にあると思います。（つまり、免疫染色にはもちろん使えます） 　一方、GFPに対する良い抗体を使えるなら、凍結切片でも良いので、GFPを免疫染色するのはかなり良い案だと思います。特に、「この細胞はGFP negativeである」と言うためには、Enhanceした上でのほうが説得力がありますよね。

(無題) 削除/引用 No.2174-8 - 2010/03/07 (日) 10:21:29 - みみ 細胞染色の経験しかありませんが，anti-GFPで染色した方が良いと思います。PFA固定してもGFPは見えますが，褪色が早く写真を撮るのに苦労しました。染色したほうが安心です。

(無題) 削除/引用 No.2174-7 - 2010/03/07 (日) 07:45:42 - KR 三人さん PFA固定が短いとやはりGFPが流れ出てしまうことがあるのですね。実は、全く固定しないで凍結サンプルを作成してみたことがあり、その時、GFPが確実にある場所で全く観察できなくなってしまいました。全く固定しなかったのが原因だと思いますが、流れ出てしまったのだと思います。 通りすがりさん 「凍結切片でGFPをそのまま観察する」というのが、いまはFirst choiceではないというのは、興味深いです。Vibratomeで切片を作成する場合、凍結ではなく、パラフィンや新鮮切片ということになるのでしょうか？どのようにサンプルを作成すればよいのでしょうか？？ できそうなら、Vibratomeも試してみたいと思います。 Vibratomeでも、免疫染色ができるのであれば、それが一番良いような気もしてきたのですが、Vibratomeで切片を作成すると、免疫染色はできるのでしょうか？ 愚問かもしれませんが、小生、凍結切片の免疫染色しか行ったことがないため、少し具体的に教えて頂けると助かります。 もしくは、最後にあるように、免疫染色するなら、凍結切片でGFPを免疫染色して緑の蛍光をEnhanceしてしまうほうがよいのでしょうか？

比較したことはないです 削除/引用 No.2174-5 - 2010/03/06 (土) 23:59:50 - 通りすがり ＞３人さん 　実は、３時間固定と一晩固定を厳密に比較したことはないです。もし一晩でダメなら、短くすることを私なら試す、という程度の発言でした。（少し無責任でした） 　固定が長いほうが良いか短いほうが良いかということは、これは免疫染色される分子の抗原性しだいという部分も大きいと思います。ただ、（組織の大きさにもよりますが）３時間固定が短いためにGFPが流れ出てしまうということは経験したことがないです。 　・・・というような議論よりも、「凍結切片でGFPをそのまま観察する」という部分が今やFirst choiceではないような気がするのです。アポトームや共焦点が普及しているご時世ですから、Vibratomeの方が良いように思うので。凍結切片かVibratomeかという比較であれば、GFPそのものの蛍光も、その他の分子の抗原性もVibratomeの方が高く保持されるということは（一般論として）言うことはできると思います。 　さらに加えると、どうせ免疫染色するなら、GFPも免疫染色して緑の蛍光をEnhanceしてしまえば良いのではないかとも思います。（Hostの関係で可能であればですが)

(無題) 削除/引用 No.2174-3 - 2010/03/06 (土) 13:21:40 - ３人 PFA固定のあとでPFAを除きさえすれば蛍光は十分回復します。理由はよくわかりませんが。3時間で良くて一晩では暗くなるからやめた方が良いというのが通りすがりさんの意見なら、それはどうかなと思います。何を見るのかによりますが、細胞ですらPFA固定は短いとおそらく分子間の架橋が十分できないために中の構造が動いてしまうくらいなので、組織だと還流固定しても一晩は必要でしょう。

少しだけ修正 削除/引用 No.2174-2 - 2010/03/06 (土) 09:14:48 - 通りすがり 　一つの点としては、４％PFAの浸漬固定を一晩ではなく、３時間程度に抑えるというのはどうでしょうか。 　また、凍結切片でなくて良いのであれば、固定した組織をそのままVibratomeなどで薄切してしまえばよいと思います。切片は５０umほどの厚さがあると思いますが、ConfocalやApotomeのようなシステムを使えば、厚さは気にならないでしょう。（GFPはそのまま見ることを想定されていると思いますが）抗原性の保持という点については、凍結切片よりも高いはずです。 　もちろん、前提をひっくり返してGFPをImmunostainingしてEnhanceするというのも一つの方法でしょう。この場合、凍結切片で一晩固定でも全く問題ないと思います。

脳のGFP蛍光を保持する免疫組織染色サンプル作製方法 削除/引用 No.2174-1 - 2010/03/06 (土) 02:15:46 - KR GFPの蛍光を保持する脳の免疫組織染色サンプル作製方法でよい方法があれば、教えて頂きたく思います。 使用サンプルは、マウス脳。 現在使用している方法は、４％PFA灌流後、whole brain で４％PFA overnight, その後、30%スクロースで2overnights, OCTコンパウンド・20%スクロース液で、ドライアイス・アセトン上で包埋。 可能な限りでかまいませんので、詳細に(サンプル、溶液の濃度、時間等を含め)アドバイスがあれば、よろしくお願いします。

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