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少量の細胞でFACS解析 トピック削除
No.2171-TOPIC - 2010/03/05 (金) 16:18:28 - 8823
教えていただきたいことがあります。


現在細胞周期解析をFACSで行っています。
tgマウス胎仔組織内の特定の細胞集団がGFPで標識されていて、GFP細胞集団の細胞周期を解析したいと思っています。


手順としては

↓トリプシン処理
↓トリプシン反応停止、wash
↓1%PFA固定
↓wash
↓70% EtOHでON以上
↓wash
↓PI染色
↓解析

を行い、FACS解析を行っています。


totalの細胞数が数万個と少なく（そのなかでGFP細胞は千個くらい）、PFA固定後、washを行った後の遠心まではちゃんとペレットが確認できるのですが、EtOH処理後の遠心ではペレットが確認できず、細胞があるのかどうなのか分からず、液をできるだけのこしながら作業を進めているのですが、とても気持ち悪いです。遠心は3000rpm、5minで行っています。



実際その日その日のさじ加減というか、細胞数が確保できるときもあれば、とれないときもあり。困っています。



何かよい方法はありませんでしょうか？
感覚としてはEtOH処理後、大きくlossしているように思います。
ご教示いただければ幸いです。
　
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(無題) 削除/引用
No.2171-8 - 2010/03/06 (土) 20:25:46 - (-.-)
おそらく細胞がチューブの壁に付着してロスしているのではないかと思われます。

以前同じような現象に悩まされましたが、1時間〜O/Nくらい血清で処理したチューブを用いたところ改善しました。

ずれますが 削除/引用
No.2171-7 - 2010/03/06 (土) 08:58:00 - キャリア
PIは細胞膜透過性がないはずです。

http://www.beckmancoulter.co.jp/product/product01/download/APT-4.pdf

よってEtOH処理かなんらかの処理がいると思います。
PFA固定は気がつきませんでしたが、EtOHで遊離しやすい細胞質のGFPをとどめておくのに使っているのだと思います。

(無題) 削除/引用
No.2171-6 - 2010/03/05 (金) 21:45:50 - TK-1
>[Re:4] キャリアさんは書きました :
> ちょうど、キャリアDNAを使うように、HeLaなどをキャリアとしていれたらどうでしょう？
>
> GFPのシグナルがしっかりしていれば、GFPマイナスのHeLaはGatingでほぼ１００％除けるはずです。
>
> （ふつうエタノール処理はしますね。PIが膜を透過しないので）

エタノール処理は要りません。そんなことしてGFPが消える方が嫌だと思います。ただPIの場合RNAにもくっつくので、RNAse処理をしないとデータが変わります。一番簡単なのはpFAで固定して、DAPIだと思います。UVがいりますが。PIしか無いのであれば、pFAで固定して、saponinか何かで膜処理をして、RNase、PIかなあ。

ペレットの問題であれば、CD45のallotypeが違う細胞をキャリアーに入れればいいんじゃないでしょうか。

むしろPFA固定って、この場合、必要なんでしょうか？ 削除/引用
No.2171-5 - 2010/03/05 (金) 21:42:42 - TS

(無題) 削除/引用
No.2171-4 - 2010/03/05 (金) 19:23:34 - キャリア
ちょうど、キャリアDNAを使うように、HeLaなどをキャリアとしていれたらどうでしょう？

GFPのシグナルがしっかりしていれば、GFPマイナスのHeLaはGatingでほぼ１００％除けるはずです。

（ふつうエタノール処理はしますね。PIが膜を透過しないので）

(無題) 削除/引用
No.2171-3 - 2010/03/05 (金) 17:54:50 - Boston
EtOH 処理の際、５０−１００uL でペレットを処理すれば良いです。氷上、３０分も置けば、重力で、細胞の多くは下の方へ移動します。もっとこだわるのであれば、２００uL PCR tube を使えば、ペレットも分厚くなって、ロスが減ります。

(無題) 削除/引用
No.2171-2 - 2010/03/05 (金) 17:45:34 - うーん
EtOH処理の目的はなんですか？

必要な高低なのでしょうか？
70 % EtOHでO/Nでもしたら脱水して細胞の形態をとどめていると考える方が無理があると思いますが、、如何ですか？

教えてください。

少量の細胞でFACS解析 削除/引用
No.2171-1 - 2010/03/05 (金) 16:18:28 - 8823
教えていただきたいことがあります。


現在細胞周期解析をFACSで行っています。
tgマウス胎仔組織内の特定の細胞集団がGFPで標識されていて、GFP細胞集団の細胞周期を解析したいと思っています。


手順としては

↓トリプシン処理
↓トリプシン反応停止、wash
↓1%PFA固定
↓wash
↓70% EtOHでON以上
↓wash
↓PI染色
↓解析

を行い、FACS解析を行っています。


totalの細胞数が数万個と少なく（そのなかでGFP細胞は千個くらい）、PFA固定後、washを行った後の遠心まではちゃんとペレットが確認できるのですが、EtOH処理後の遠心ではペレットが確認できず、細胞があるのかどうなのか分からず、液をできるだけのこしながら作業を進めているのですが、とても気持ち悪いです。遠心は3000rpm、5minで行っています。



実際その日その日のさじ加減というか、細胞数が確保できるときもあれば、とれないときもあり。困っています。



何かよい方法はありませんでしょうか？
感覚としてはEtOH処理後、大きくlossしているように思います。
ご教示いただければ幸いです。
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