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(無題) 削除/引用 No.2168-8 - 2010/03/10 (水) 20:47:23 - ~ ネガティブに考えると、サンプルの塩濃度などの違いで移動度が変わったとか。 サンプル量やレーン数に余裕があれば、 異なるサイズのバンドを示すサンプルを混ぜてたものも一緒に泳動して、 2本バンドが出るかを見ておいてもいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2168-7 - 2010/03/10 (水) 18:26:53 - c 5KDaくらいキレイにシフトしているということだと、糖鎖の付加やユビキチン化のように他の蛋白質が付加したという可能性は少ないかもしれないですね。ユビキチン化などでは、ターゲットの全分子が一様に修飾されてキレイにシフトするということはあまりなくて、実際にはごく一部の分子が修飾されて高分子側にシフトするので、修飾され損なった大部分は依然として元の位置に検出されることが多いです。またポリユビキチン化やSUMO2/3化などではこれらはポリメライズするのではるか上のゲルトップの辺にスメアっぽく見える感じになり、きれいにバンドになることは少ないです。 お話聞く限りではリン酸化とかアセチル化とかメチル化とかみたいな側鎖部分の修飾で分子の荷電状態やSDSとの相互作用が少しばかり変化して移動度が変化したか、あるいは本来は限定分解でCあるいはN末の数残基が切り取られて成熟型になるはずが、切り取られなくなって前駆体型として検出されたかそういったところが怪しいかなと思います。 IPできる抗体ならば各々のステージのライゼートから調べているその蛋白質をIPでenrichmentしてきて、IP物を電気泳動してそれを可能性ありそうな各種修飾体抗体でwesternしてみたらどうでしょうか。ちょっとお金かかるし買っても少し無駄になるかもしれないけど、それだけの価値はありそうな気がするので。LC-MS/MSができるならばIP物をトリプシン消化して、それで調べるのが一番いいかなと思います。

ありがとうございます 削除/引用 No.2168-6 - 2010/03/10 (水) 17:41:11 - あき 多くの情報をくださり、ありがとうございます。 うーんさん ＞＞糖鎖付加などで論文検索してみてください そうですね。やはり糖鎖付加ですか・・・可能性は大いにありえますね。 今、一生懸命、糖鎖付加などで論文を探しています。 ららさん ＞＞再現性をしつこくチェック サンプルが集まったので土曜から、もう一度挑もうと思っています。 思うような結果が出ればいいんですが、今回とも違ったり、思うような結果ではなかったらどうしようかと今から不安です Cさん ＞＞分子量としてどのくらいズレますか。大きくなりますか。小さくなりますか。本来の分子量の位置にはシグナルは残ってますか。それとも完全にシフトしてますか。 分子量としては、5kDくらいずれています。 本来の分子量の位置にはシグナルは残っていません。完全にシフトしています。 やはり、再検討が必要でしょうか？？ takeさん ＞＞抗体は複数種類で試していますか？ 交代は１次抗体と２次抗体だけなのであまりつかっていません やはり、もう少し実験が必要なのでしょうか？？

検出のバンド結果がおかしい？？？ 削除/引用 No.2168-5 - 2010/03/08 (月) 21:46:43 - take みているものが正しいがみているものが見たいものかは分からない。 抗体は複数種類で試していますか？ N末とC末のそれぞれの抗体とかポリクロとか。 モノクロだと、エピトープが修飾されると見えなくなるものもありますよ。カタログにはそうは書いてないかもしれないけど。 早いステージで同調分裂してると、細胞周期の影響かも。 やはり、再現性。

(無題) 削除/引用 No.2168-4 - 2010/03/05 (金) 12:02:57 - c 糖鎖付加、ユビキチン化、ユビキチン類縁蛋白質付加などの翻訳後修飾や、部位特異的分解などいろんな可能性が考えられるので、結果自体は必ずしもおかしくないですし、むしろ非常に重要な点を見つけている可能性があるようにおもいます。分子量としてどのくらいズレますか。大きくなりますか。小さくなりますか。本来の分子量の位置にはシグナルは残ってますか。それとも完全にシフトしてますか。

(無題) 削除/引用 No.2168-3 - 2010/03/05 (金) 09:54:07 - らら ポジティブに考えると非常に面白い結果なんじゃないでしょうか？ ですが、今後の実験は慎重に。 まずは再現性をしつこくチェックでしょうね。

(無題) 削除/引用 No.2168-2 - 2010/03/04 (木) 22:42:40 - うーん 翻訳後修飾や分解など起きている可能性も視野にいれる必要性が出て参りましたね。 糖鎖付加などで論文検索してみてください。

検出のバンド結果がおかしい？？？ 削除/引用 No.2168-1 - 2010/03/04 (木) 22:32:12 - あき こんにちは。 いつもお世話になっております。 今、SDS-PAGE,ウエスタンブロットを使って実験しています。 卵の中の各ステージにおけるたんぱく質の濃度を知るために 実験を行っています。 しかし、今回出た結果で、最初のステージと次のステージではバンドが現れる位置が変わっていました。 つまり、分子量が各ステージによって違うのです。 ステージが進んだだけで、濃度は変わると考えられるのですが、バンドが現れる位置にずれが生じるのはおかしいのではないかと思っています。 また、予想では、ステージが進むにつれて濃度が増えるはずなのですが 増えて減ってと不思議な動きをしています。 やっぱり、実験の失敗でしょうか？？ また、このようなことを証明できる論文はあるのでしょうか??? 一生懸命探していますが見つかりません どうか、ご教授、おねがいします。

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