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(無題) 削除/引用 No.2154-19 - 2010/03/10 (水) 14:17:43 - USB AP様 　すみません。ご指摘の通りですね。 レトロなのでLTRと思い込んでおりました。

(無題) 削除/引用 No.2154-18 - 2010/03/10 (水) 13:45:59 - AP >私の理解ではUTRがあれば発現するように思うのですが…。 UTR = Untranslated region mRNA上で開始コドンより上流や終止コドンより下流の飜訳されない領域。 転写開始を行うプロモータとは全くかぶりません。

(無題) 削除/引用 No.2154-17 - 2010/03/05 (金) 14:18:14 - 亜出野 >> そしてHAタグはORFの真ん中あたりに入れています。 なぜ？

(無題) 削除/引用 No.2154-16 - 2010/03/04 (木) 19:03:53 - USB レトロ様 少しお伺いしたいのですが、UTRを使用しているのにCMVのプロモーターを使用しているのは何か理由があるのでしょうか？私の理解ではUTRがあれば発現するように思うのですが…。 　UTRの上流にCMVがあるのですよね。私はこのようなコンストラクトは使用したことがないのですが、可能であればCMVなどのプロモーターを持たないプラスミドを使用してみるのも手かと思います。

(無題) 削除/引用 No.2154-15 - 2010/03/04 (木) 16:41:43 - ＊ つづき また、transientでタンパクの発現は可能ですので、stableに用いた細胞にtransientで発現させて、タンパクが発現するかどうかを確認してください。 確認できるようであれば、コンストラクトを含めて、問題ない可能性が極めて高いと思います。

(無題) 削除/引用 No.2154-14 - 2010/03/04 (木) 16:39:20 - ＊ レトロさん CMVは強力なプロモーターなのですが、それ故にサイレンシングによる負の制御を受ける事がしばしばあります。 この場合、メッセージはレトロさんのように確認する事は可能なのですが、タンパクレベルでの確認になりますと、極めて難しいです。 stable細胞の構築は結構利点が沢山あるのですが、サイレンシングを受けてしまう様ですと、実験には使えません 過去のトピにもにたよな物があった様な気がします。 参考にしてみたら良いかもです。

(無題) 削除/引用 No.2154-13 - 2010/03/03 (水) 14:30:32 - 匿名 はじめまして。 UTRのせいで発現しなかった経験があります。 生体内ではUTR有りのmRNAから翻訳されているはずなのですが、強制発現ではうまくいかないことがあります。 5'側や3'側の不要なUTRをなくしたものを作ったら解決することがあります。 あと、翻訳後にプロセシングされるタンパク質で、タグ導入部分がプロセシングされて小分子になってしまい、イムノブロットで検出できなくなったことがあります。 切断部位についての情報があやふやだとこのようなことも起こります。 プロセシング後の本体の活性を知っていたので活性で確認できましたが、そうでなければ混乱しただろうなと思います。 ご参考まで。

(無題) 削除/引用 No.2154-12 - 2010/03/03 (水) 14:17:43 - レトロ ご返事ありがとうございます。 COS-1で試してみます。 ＊さん CMVプロモーターを使用しています。 問題ありでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2154-11 - 2010/03/03 (水) 11:19:46 - ＊ プロモーターが、CMVの様な強力な物をお使いではないですか？

(無題) 削除/引用 No.2154-10 - 2010/03/03 (水) 11:17:01 - KN トランジェントトランスフェクションだと、DNase処理してもRT-PCRでInputのDNAが検出されます。 DNAse反応は100％の効率でいきませんし、RT-PCRは非常に感度がいいですから。 その細胞株でのトランスフェクションの効率は確認しましたか？ GFP発現ベクターなどで効率を確認しましょう。 プラスミドの機能性を疑っているのならCOS-1に導入してみましょう。 COS-1で発現が確認できなかったらベクターのコンストラクトがおかしいか、 発現タンパク質が非常に分解されやすいかのどちらかになります。 コザックだのあれこれ議論するのはその後ですね。

(無題) 削除/引用 No.2154-9 - 2010/03/03 (水) 01:18:22 - レトロ さらに追加で。 開始コドンの4塩基前から一つは5'-CGCCATGT-3'、もう一つは5'-CGTCATGT-3' というように並んでいます。 やはりコザック配列が完全ではないためのleaky scanningでしょうか？？

(無題) 削除/引用 No.2154-8 - 2010/03/03 (水) 01:06:07 - レトロ 失礼しました。 追加します。 RT-PCRの件ですが、DNaseI処理で確認しています。

(無題) 削除/引用 No.2154-7 - 2010/03/03 (水) 01:04:37 - レトロ 皆様 返答が遅れまして申し訳ございません。 そしてレスポンスありがとうございます。 まず細胞はセレクションをかけた安定株です。 mRNAの発現はRT-PCRで確認しております。 そしてHAタグはORFの真ん中あたりに入れています。 フレームシフトがないことは確認しています。 また最初に書き忘れましたが、このタンパクをバキュロウイルス発現系で試したところ発現することは確認しています。 UTRを入れるか入れないかですが、この遺伝子はUTRがないとスプライシングを受けて違うタンパクをコードする遺伝子に変わってしまいます。なので、ぜひ入れたいところですが。。。 あと思いつくところでダメかと思うことはコザック配列くらいですが、、、関係あるのでしょうか？ 何かアドバイスがありましたらよろしくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.2154-6 - 2010/03/02 (火) 10:30:15 - n 連投失礼。 もしHAタグがN末なら、シグナルペプチドと共に切断されている可能性も。。。

(無題) 削除/引用 No.2154-5 - 2010/03/01 (月) 22:35:23 - n Leaky Scanningの可能性？？ 他には、Transientの系ならば、 RNAを回収する際にDNase処理していますよね？ でないと、細胞に導入したプラスミドをPCRで検出してしまい、 mRNAが転写されていると判断してしまう事も。 （イントロンを挟んだプライマーペアでPCRしてれば問題ないですが。）

(無題) 削除/引用 No.2154-4 - 2010/03/01 (月) 22:32:58 - window 一応確認したいのですが、 UTRを組み込んだとありますが、ちゃんとHAタグとORFのフレームはあっていますよね？ 一般的にUTRは入れる必要はないし、HAとORFの間にUTRが入っていると面倒ですし。

(無題) 削除/引用 No.2154-3 - 2010/03/01 (月) 19:19:27 - c トランジエントだと、遺伝子の発現、蛋白質の量のピークがトランスフェクション後どのくらいで来て、どのくらいで消えていくかは遺伝子／蛋白質により様々です。ピークからはずれたところでみている可能性もあります。たとえば6h, 12h, 24h,48hのように何点かでウェスタンなどで確認した方がいいです。

(無題) 削除/引用 No.2154-2 - 2010/03/01 (月) 16:08:29 - ＊ transientの系での話ですか？ それとも、stable?

転写はされても翻訳されない。。。 削除/引用 No.2154-1 - 2010/03/01 (月) 12:37:16 - レトロ すごく困っていることがあります。 とあるレトロウイルスのエンベロープタンパク質を哺乳類の細胞で強勢発現させようとしています。 方法は、UTRとORFを発現プラスミドにクローニングし、リポフェクションによって細胞に導入するというスタンダードなものです。 確認のためにRT-PCRをかけてみると導入した遺伝子は転写されているのですが、なぜだかタンパク質としては全く検出されません（ウエスタンと免疫蛍光抗体法で確認）。 HAタグでの検出を試みていますので、抗体に問題はないはずです。 ちなみにシークエンスは確認済みで全く問題ありませんでした。 どなたか同様な現象に遭遇されたことのある方はいらっしゃいませんでしょうか？ そして、もしその時に何らかの解決方法を見つけられた方がいらっしゃいましたらアドバイスをお願い致します。

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