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(無題) 削除/引用 No.2151-9 - 2010/03/04 (木) 10:31:07 - mom-a ＞要するにピペッティングだけで良いということです。 私の周りにもピペッティングだけでやっている人がいます。 しかし、セルスクレーパーを利用している人もいます。 理由は、大きなdishの場合、なるべく素早く全体にIsogen(or Trizol)をいきわたらせるにはその方が良いから、とのことです。ですので、セルスクレーパーの種類は特に問題にせず、あるものを利用されているようです。 また、ピペッティングだけで回収、あるいはセルスクレーパーで回収後に25Gシリンジでのホモジナイスをする人もいます。 こちらの理由は、DNAを切った方がRNAの回収率が上がるから、ということです。この操作をせずに、ピペッティングとボルテックスで済ませる人もいます。 この辺の細かい作業をどこまで省略するかは、ケース・バイ・ケースかと思います。人によって手加減も違うでしょうから。

(無題) 削除/引用 No.2151-8 - 2010/03/03 (水) 23:48:45 - み >[Re:7] セル太郎さんは書きました : > みなさまアドバイスありがとうございます。 > > 試しに、６ｃｍディッシュから培地を除去し、ＩＳＯＧＥＮを添加してみました。 > そうすると、細胞が変性してはがれていきました。 > > （はがれるまで放置は良くないと思い、添加後は直ぐに1000μlチップの裏で剥がして22Gシリンジでホモジナイズしました） > お節介かと思いますが・・・もっと簡便にできます： isogenを添加して、ピペッティングで吹きつけて細胞をはがし(直ぐにドロッと溶解してくるでしょう）、何度かピペッティングしてマイクロチューブなどに回収するだけで大抵良いです。 要するにピペッティングだけで良いということです。 isogenの類の組成を知っていれば細胞からRNAを抽出するのにどのような操作で充分かは検討つくはずです。

(無題) 削除/引用 No.2151-7 - 2010/03/03 (水) 20:28:13 - セル太郎 みなさまアドバイスありがとうございます。 試しに、６ｃｍディッシュから培地を除去し、ＩＳＯＧＥＮを添加してみました。 そうすると、細胞が変性してはがれていきました。 （はがれるまで放置は良くないと思い、添加後は直ぐに1000μlチップの裏で剥がして22Gシリンジでホモジナイズしました） まだ解析まで進んでいませんが、この方法でいけそうな気がします。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2151-6 - 2010/03/02 (火) 10:54:36 - ats 小さいdishなら、1mLチップを逆さに使って掻き取ることも可能です。 大きなdishの場合は希望の幅のスクレーパーがないので、東急ハンズなどでシリコンゴムのシートを購入し切ってオートクレーブして使っています。厚さは3mmほどを使っていますが、堅さの 好みで選べばよいと思います。2cmx4~6cmほどに切ると縦横どちらでも使えて割と万能（指の大きさによる）。 私も回収前にはトリプシンＥＤＴＡ処理はしないです。

(無題) 削除/引用 No.2151-5 - 2010/03/01 (月) 21:46:01 - toyo >このような手法があることは知っていましたが、この場合でもセルスクレーバーなどで剥がす作業が入るのではないでしょうか？ お節介かも知れませんが横レスさせてもらいます。 例えばRNeasyのマニュアルには確かにそのような記述がありますが、 細胞は完全に溶解しているので、わざわざ剥がす必要はありません。 lysateをvortexなどで混和した後、ピペットマンで吸い取るだけで大丈夫です。

(無題) 削除/引用 No.2151-4 - 2010/03/01 (月) 20:18:13 - セル太郎 回答ありがとうございます。 ご紹介いただいた商品を検討してみたいと思います。 >お節介かもしれないですが、接着細胞からの蛋白・RNA抽出は、PBSでリンスした後、ダイレクトにlysis bufferをdishに入れる方法で行うのが良いかと。 アドバイスありがとうございます。 このような手法があることは知っていましたが、この場合でもセルスクレーバーなどで剥がす作業が入るのではないでしょうか？ 研究室にセルスクレーバーが常備されていなかった点やトリプシン処理で良好なＷＢ結果がえられていたため、ＷＢ解析ではトリプシンで剥がしてＰＢＳでペレットを洗浄する工程が研究室で慣習化しておりました。 今回、ＲＮＡは蛋白よりも分解に気をつけなければならないと思い、質問させていただきました。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2151-3 - 2010/02/27 (土) 23:32:48 - toyo RNA抽出であれば、大抵の試薬はdishに直接添加して使うようになっていると思いますが、わざわざ細胞を剥がす必要があるのでしょうか? (WB用サンプルにしても、サンプルバッファーをdishに直接添加すれば大抵の場合問題ないと思います。) 私たちのラボでは、cell scraperは細胞をdishごと10% TCAに浸漬してWBサンプル用に回収(TCA沈殿で濃縮)するときのみ使用します。 1) cell scraperとしてはcorningの#3010を常用しています。 比較的安価ですが、先端がプラスチック製で細胞が壊れるような印象があるので、 細胞を分画したい場合にのみSARSTEDTの#83.1830(先端のみゴム製)を使用しています。 細胞が壊れるとRNAも壊れるということであれば、後者の方がよいかもしれません。 2) サンプルが直接触れるので使い捨てにしていますが、 以前お金がなかった時期は洗って再利用していたと聞きました。 3) トリプシン処理やスクレープは細胞にとって強い刺激になりますが、 見たい対象(mRNA)にとって影響がなければどちらでも構わないと思います。 ただし細胞が壊れてRNAが壊れる可能性があるので、抽出試薬(Trizolや BufferRLTなど;RNaseを阻害)を直接dishに添加する方がよいと思います。

(無題) 削除/引用 No.2151-2 - 2010/02/27 (土) 23:20:00 - み これはいかが？ http://www.sumibe.co.jp/sumilon/cellscraper.html お節介かもしれないですが、接着細胞からの蛋白・RNA抽出は、PBSでリンスした後、ダイレクトにlysis bufferをdishに入れる方法で行うのが良いかと。 細胞をtrypsinまたはscraperで剝す行為により、細胞内の状態は変化しますよね（当然、余計なシグナルも入るし）。

セルスクレイパーどこのメーカーが良いですか？ 削除/引用 No.2151-1 - 2010/02/27 (土) 21:56:02 - セル太郎 お世話になります。 このたび、接着細胞からのＲＮＡ抽出とリアルタイムＰＣＲ解析を行うことになりました。 当研究室では今まで浮遊細胞のみを扱っており、接着細胞でのＲＮＡ抽出は初めてです。 周りはウエスタン用サンプリングのときと同じように、トリプシン・ＥＤＴＡで剥がせば良いとの意見ですが、セルスクレーバー（ラバーポリスマン？）を使った方法も検討してみようと思っております。 質問です １）皆様、どこのメーカーの製品を使っていらっしゃるのでしょうか。 ２）使い捨てでしょうか？それとも洗って再利用は可能でしょうか。 ２）結果として、トリプシンＥＤＴＡ処理とセルスクレーバー、どちらがお勧めでしょうか。 ご存知の方がいらっしゃいましたらご協力お願いします。

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