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細胞表面のビオチン化 トピック削除
No.2139-TOPIC - 2010/02/25 (木) 11:42:58 - ＴＫ
細胞表面をビオチン化したいのですが、
1×10E7cellsに20mM NHS-Biotin/PBS(total 1ml)
でビオチンを加え、RT30min,回転混和をして、一部をとりｽﾄﾚﾌﾟﾄｱﾋﾞｼﾞﾝで標識しﾌﾛｰｻｲﾄﾒｰﾀｰで標識を解析しても、全くビオチン化されていることが確認できません。

一応ｺﾝﾄﾛｰﾙとしておいているビオチン化されていない細胞を抗体(1stﾋﾞｵﾁﾝ,2ndｽﾄﾚﾌﾟﾄｱﾋﾞｼﾞﾝ)で染色したものは染色が確認できているので、ｽﾄﾚﾌﾟﾄｱﾋﾞｼﾞﾝ自体に問題はないと思っています。

どのような問題が考えられますか？
困っています。
　
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(無題) 削除/引用
No.2139-4 - 2010/03/07 (日) 14:57:45 - 奈々氏
NHSだけでは反応が不十分ならＥＤＣなどの水溶性カルボジイミドを加えてみればいかがでしょうか？
反応はいたってシンプルですので
難しいことはないと思います
それと溶液のｐＨは大丈夫でしょうか

Re:推測 削除/引用
No.2139-3 - 2010/03/04 (木) 19:04:40 - ＴＫ
書き込みありがとうございます。

Biotinの活性についてですが、用事希釈していますし、新品のものでも同様の結果でした。

原因が分からず困っています。。

推測 削除/引用
No.2139-2 - 2010/02/25 (木) 21:42:02 - 奈々氏
NHS-biotinの活性が落ちているということはかんがえられませんか？

細胞表面のビオチン化 削除/引用
No.2139-1 - 2010/02/25 (木) 11:42:58 - ＴＫ
細胞表面をビオチン化したいのですが、
1×10E7cellsに20mM NHS-Biotin/PBS(total 1ml)
でビオチンを加え、RT30min,回転混和をして、一部をとりｽﾄﾚﾌﾟﾄｱﾋﾞｼﾞﾝで標識しﾌﾛｰｻｲﾄﾒｰﾀｰで標識を解析しても、全くビオチン化されていることが確認できません。

一応ｺﾝﾄﾛｰﾙとしておいているビオチン化されていない細胞を抗体(1stﾋﾞｵﾁﾝ,2ndｽﾄﾚﾌﾟﾄｱﾋﾞｼﾞﾝ)で染色したものは染色が確認できているので、ｽﾄﾚﾌﾟﾄｱﾋﾞｼﾞﾝ自体に問題はないと思っています。

どのような問題が考えられますか？
困っています。
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