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(無題) 削除/引用 No.2138-5 - 2010/02/27 (土) 13:18:57 - ats ccdB耐性大腸菌DB3.1株を使って、幾つかの自作DESTベクターを作っています。DB3.1株はエレクトロポレーション用コンピテントセルを自作していますが、何度やっても通常のクローニング用株より形質転換効率は低くなります(よくて10^7/ug後半）。なので、DNAを多めにエレクトロポレーションしています。具体的には、共沈剤を加えたligation液をEtOH沈殿してDDWに溶かして使用しています。 最近新たにDESTベクターを作るときは、自殺遺伝子としてccdB遺伝子よりsacB遺伝子を使うことが多くなりました。

普通にGataway 削除/引用 No.2138-4 - 2010/02/26 (金) 18:40:26 - ema Invtrogenから買って実験したとき、結構コロニー数が少なかったです。１００個満たない。 これにはコンピテンシー書いてないけど、普通企業売りのコンピテントセルって１０−９オーダーのですよね。それから考えると１０−７から−８オーダーだとだめなのでは？

(無題) 削除/引用 No.2138-3 - 2010/02/26 (金) 15:24:58 - K >No.2138-2 - 2010/02/26 (金) 14:52:54 - ザンギ そのディスティネーションベクターは自作でしょうか？ その大腸菌は普通のプラスミドなら形質転換できるんでしょうか？ ディスティネーションベクターはとある機関から分与頂いたものです。 このコンピテントセルは通常のベクターもトランスフォーム出来ませんでした...。

(無題) 削除/引用 No.2138-2 - 2010/02/26 (金) 14:52:54 - ザンギ そのディスティネーションベクターは自作でしょうか？ その大腸菌は普通のプラスミドなら形質転換できるんでしょうか？

ccdB耐性の大腸菌コンピテントセルについて 削除/引用 No.2138-1 - 2010/02/25 (木) 10:47:26 - K いつも拝見させて頂いています。 gatewayに用いるベクター（ディスティネーションベクター）をccdB耐性大腸菌に遺伝子導入しようと考えております。 ccdB耐性大腸菌を培養後、CaCl2処理または10%グリセロールに置換して、ケミカルまたはエレポで数回導入を試みていますが、うまく入りません。 通常のDH5alphaやJM109系統の大腸菌では全く問題無く、コンピテンシーも10^7-8オーダーで作製出来ている方法です。 何らかの処理を加えることで効率を上げることが出来るのでしょうか？ それとも自作は難しく、基本的に購入するしか無いのでしょうか？

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