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原因はいくつか 削除/引用 No.2137-7 - 2010/03/07 (日) 22:54:16 - take このマニュアル http://www.brc.riken.jp/lab/dna/ja/manual.html の「プラスミドの培養について」あたりを読んでください。 アンピシリンの場合、大腸菌を長い時間培養しすぎると、 プラスミドが脱落することがあります。 先に回答がありましたが、サテライトコロニーが出る現象が、 液中で起こっていると考えてください。培養途中でアンピシ リンを入れるとか、集菌して培地を換えるとかできます。 アンピシリンの枯渇なら、長時間培養が原因となるので、 短時間で10ml培養をし、それを20本でも50本でも仕掛けて、 大量培養としたほうがいいです。 他にも、漏れタンパクが大腸菌に嫌われることが同時に起 こっている可能性があります。 完全ではないですが、フィルター滅菌した10%グルコースを 0.1-1%いれて発現を抑制できる場合が有ります。 プレートで生えるなら、プレートにストリークして、直に 菌を回収する方法もできます。 10cmプレーとなら、2 ml くらいのTEで寒天表面を洗って 菌を回収します。 ファージの感染もありえるので、DNA をフェノール抽出 してから菌を形質転換すると良くなることが有ります。 65℃でファージを殺すことができるか、検討している ところです。これについては、機会があれば。 ホストを変えてみるのもいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2137-6 - 2010/02/25 (木) 14:49:09 - heimlich 自分はplasmidをとる際に、質の良いものが欲しいときにはpAdeno-X plasmidをとる際のプロとコールを転用しております。こうすることで、大体どのplasmid DNAでも収量がおよそ1.5倍くらいにはなります。 やり方は、単にminiprep開始後４時間くらいしたら、２倍量の抗生剤を追加するだけです。培養時間は、１２時間以内だと増殖が少し劣ってることが多いので、15〜16時間くらい培養します。

(無題) 削除/引用 No.2137-4 - 2010/02/25 (木) 10:26:13 - 中年 培地中のアンピシリンは、実はプラスミドを持った大腸菌が増え出してちょっと濁ったくらいで枯渇してしまっています。害の無いプラスミドであれば、選択の失われた後もプラスミドを持った菌が増え続けますが、toxicな作用を示すプラスミドだと、その後はプラスミドを失った菌が優先して増えるので、菌体量に対してプラスミドの収率が下がります。 同様のトピックが以前にもありました。 http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech2/biotechforum.cgi?mode=view;start=3;Code=251 http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech/biotechforum.cgi?start=1;mode=view;Code=3256

(無題) 削除/引用 No.2137-3 - 2010/02/25 (木) 09:26:57 - ~ >どう理解したらよいのでしょうか？ プラスミドが抜け落ちていっているのかもしれません。 収量はどのくらいで、その収量のまま必要量を取るには、 どの位の培地量を培養する必要があるのでしょうか？ １つの対応策は、条件検討に時間を取らず、 力技で大量培養して実験を進めてしまう方法はあります。 漏れが少ないベクターに変えるという手段もあるとは思いますが、 そこまでやったことがありません。 30度や25度培養などで収量が増える場合はあります。 プレート上で培養し、そのコロニーをかきとってプラスミド精製をすると、収量が増える場合もあります。

(無題) 削除/引用 No.2137-2 - 2010/02/25 (木) 08:40:46 - 苦労人 収量が低くても、泳動すると正しいサイズの薄いバンドは見えるという事ですよね。 それが正しいクローンであれば、Maxiprepで大量調整してみてはいかがでしょうか？ 詳しい原因は分かりませんが、大腸菌が増えるのにプラスミドの収量が低いことはよくあると思います。

大腸菌は増えるのにプラスミドの収量が非常に低い 削除/引用 No.2137-1 - 2010/02/25 (木) 02:50:33 - yy 現在、大腸菌でのタンパク発現用にプラスミドを作っているのですが、トラブルが頻発しています。というのは、大腸菌は増えるのに、集菌してミニプレップをしてもプラスミドがほとんど取れない（収量がとても低い）のです。 プラスミドはpGEX-4Tに興味のある遺伝子のCDSが入ったものです。 興味のある遺伝子の産物がtoxicなため、leakyな発現が悪さをしているのかもしれません。それでも、大腸菌が増えないのなら理解できるのですが、大腸菌は増えるのにプラスミドの収量が非常に低いというのは、どう理解したらよいのでしょうか？ コントロールとして平行して、別の遺伝子のCDSが入っているpGEX-4Tベクターをもった大腸菌も増やしていて、こちらは増殖、プラスミドの収量ともに問題ないので、操作に問題はないと考えています。 また、最初はDH5alphaを使っていて、次にJM109を試しましたが、たいした違いはありませんでした。 このようなことは時々起こりえることなのでしょうか？ 皆様のご経験など、お聞かせいただけたらと思います。 よろしくお願いします。

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