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界面活性剤濃度ではない？ 削除/引用 No.2132-8 - 2010/03/03 (水) 16:54:05 - Mfk 界面活性剤濃度を0.5%，0.2%，0.1%になるように希釈してやってみました．が，結果は変わりませんで，ターゲットはビーズにくっつかず上清に残ったままでした．新年度になったら別の抗体を使ってやってみます．

(無題) 削除/引用 No.2132-7 - 2010/02/24 (水) 09:49:52 - Mfk 皆様，いろいろな情報をありがとうございます． > ライゼートというのは、可溶化bufferでホモジナイズ後に遠心して不溶物を除いた上清（可溶化した画分）という理解でOKですね。 そのとおりです，ライセートというのは適当ではなかったです． どうも，抗体がアカんのではないかというご意見が多いですね．Santa Cruzでは複数のGFP抗体を売っており，その中にはIP可と書いてあるのと書いてないのがあるので，書いてあるものはいけるんだろうと思ってそれを購入した次第です．モモさんや み さんに教えていただいた，実績のある抗体でやってみるとよいのでしょうが，いま年度末で買い物ができないんで，そのオプションは少し先になりそうです． とりあえず界面活性剤濃度を下げてうまくいくかどうかやってみます．結果が出たらまたご報告します．

(無題) 削除/引用 No.2132-6 - 2010/02/24 (水) 03:42:49 - み サンタくるーずのデータシートは全てIP,staining,WB可能と言っていたような・・・。 写真載せていますか？？？ 特別な事情がない限り、buffer組成を工夫するより抗体を変えた方が良いでしょう。 クロんテックのラビットポリクロはIP,staining,WBいずれも問題ないです。 強制発現でしたら抗原量が異常に多すぎて、抗体不足で効率良く落とせていないように感じる場合があるかもしれませんが、１−２マイクログラムも抗体使用していれば、IP能が保証されているものなら落ちるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.2132-5 - 2010/02/24 (水) 01:45:02 - モモ Mfkさんが今お使いのものと同じかどうかはわかりませんが、SC社のGFP抗体をいくつか試したときに免沈はうまくいかなかった経験があります。 I社のJL-8というクローンを今は使っていますが、そこそこ免沈できています。 ５年以上前の話ですが、GFPの免沈は一般に効率が悪いといわれていたような気がします。

(無題) 削除/引用 No.2132-4 - 2010/02/24 (水) 01:34:25 - c 返信ありがとうございます。ライゼートというのは、可溶化bufferでホモジナイズ後に遠心して不溶物を除いた上清（可溶化した画分）という理解でOKですね。お使いの会社の抗体は比較的濃度が薄いですね。抗体量を2~5倍くらいまで増やしてみるとどうでしょう。経験では回収率が悪いときは抗原でなくて抗体の方の量を増減させてほうが結果はかなり変わることがあります。protein beadsをお使いということなので、液量の増加の心配はないと思うのでどうでしょうか。またインキュベート時間（室温、数時間と4C O/N)でもかなり違うことがあります。

可溶化はされています 削除/引用 No.2132-3 - 2010/02/24 (水) 00:35:40 - Mfk cさん，さっそくにありがとうございます． 今用いている界面活性剤で可溶化は確認ずみです．免疫沈降前のライセートをウエスタンするとシグナルはばっちり出ます． 次に抗体がIPに使えるものかどうかについては，一応IP可能という能書きのものですが，確認はできていません．Santa CruzのGFP抗体（全長を抗原にしたウサギポリクロ）です．この抗体をProtein G beadsにくっつけてから，GFP融合タンパク質を沈降させようとしています．検出は融合相手に対する抗体またはmouse monoclonal GFP抗体でやってます．免疫沈降操作前後で上清をウエスタンにかけてもターゲットのバンドは少しも薄くならないし，ビーズから溶出させたものでは検出できない，という状況です．Protein G beadsと抗体の結合は確認しているので，あとは抗体と抗原の結合であろうと思っています． ならば薄めたらいいのか，という点を明日確認しようと思うのですが，しかしそもそも薄めてもいいものかどうか，を教えていただきたく投稿させていただいた次第です． よろしくお願いいたします．

2つほど確認を。 削除/引用 No.2132-2 - 2010/02/24 (水) 00:10:43 - c 今用いている可溶化方法で目的の膜蛋白質が可溶化されていることは確認済みですか。界面活性剤の種類や濃度により可溶化出来る目蛋白質の種類は変わってくると思うので。また用いている抗体は免疫沈降に適用が可能な抗体ですか。ウェスタン等で非常に良くても、免疫沈降はエピトープの場所や、抗体の抗原に対するavidityよるので免疫沈降にも同じように使えるというのはあまり多くないです。添付書には免沈できると書いてあっても出来ないものもあります。 あとかなり難溶性蛋白質の場合に、いつも万能というわけではありませんが、SDSで可溶化してからトライトンかNP-40を含むbufferで希釈してSDSを0.1%以下くらいまで希釈してIPという方法でうまくいく場合もあります。

膜蛋白質の免疫沈降と界面活性剤 削除/引用 No.2132-1 - 2010/02/23 (火) 23:52:46 - Mfk 皆様，いつもお世話になっております．膜蛋白質の可溶化に使う界面活性剤について教えてください． 膜蛋白質を界面活性剤で可溶化して免疫沈降をしようとしていますが，抗体がうまくターゲットをつかまえてくれませんで，ライセートに加えている界面活性剤の濃度が高いのでは，と疑っています．それで，ライセートを希釈して界面活性剤濃度を下げたうえで，抗体をくっつけたビーズとインキュベートしたらよいかと思っています．しかしこのとき，希釈したときの界面活性剤濃度がcmc以下だと，可溶化されていた膜蛋白質も再度不溶化してしまうのでしょうか． Triton X-100などのcmcが低い界面活性剤を使えばよいのだと思いますが，事情により，可溶化にはオクチルグルコシドとかCHAPSとかのcmcが高いものを使いたいと考えています．可溶化はOG，希釈はTritonのようなやりかたも可能なのでしょうか．またそのとき，OGでできていたミセルがTritonに置換されていったりということはないのでしょうか？ よろしくお願いいたします．

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