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(無題) 削除/引用 No.2131-5 - 2010/02/24 (水) 15:51:52 - AP >すでに他の数種類のプライマーを使って、その微生物の存在自体は確認できており、いることは確かだと考えてます。それで、このプライマーを使ったときだけ、最初の一回目とアニーリング温度を変えた時にちょこっとだけしか拾うことが出来ないので原因は何か考えていました。 ほかのプライマーセットでちゃんと動く系であり、サンプルDNAであるということですから、サンプル保存や凍結融解に原因があるというわけじゃないようです。サンプルが全ゲノムを含む精製DNAで濃度も十分にたかいようですから吸着ロスもないでしょう。 やはり、PCRの条件がうまくなくて、artifactをみているだけじゃないでしょうか。再現性をとるというのはartifactでないことの裏付けをとるためですから、それが出来ないということはartifactである、と素直に考えればそうなりますね。 特定のプライマーセットに限ってPCRがうまく走らないときは、プライマーを変えるのが早道です。ちょっと内側か外側にずらすとか、3'末端が違う配列で終わるようにするとか。 論文を参考にしている条件のようですが、記載されているプライマーの配列が間違っているとか、プライマーの合成や保存にトラブルがあったとか、材料生物に多型があって論文に出ているのとゲノム配列がちがっているとか、あってもおかしくないです。

(無題) 削除/引用 No.2131-4 - 2010/02/24 (水) 13:04:19 - ~ >植物組織に感染している微生物をPCRで拾うことです 条件検討ではまっているときは、ポジコンが必要かと思います。 植物組織ごととってきているサンプルを現在使っているのであれば、 微生物のみのゲノムDNAを試してみてはいかがでしょうか。 >templateは約125ngです。 動物のゲノミックPCRしかやったことが無いのですが、100ng/100uL位でやっています。 貴方の場合は2〜5倍くらい濃いです。 植物の方がゲノムDNA精製時にごみを持ち込みやすいと思うのですが、 テンプレートの入れすぎで反応が阻害されているおそれはありませんか？ （他のプライマーではかかるのであれば、そのプライマーと結合する植物ゲノムDNA配列が多いためなど）

(無題) 削除/引用 No.2131-3 - 2010/02/24 (水) 09:30:01 - Trap APさんありがとうございます。わかる限りで情報を追加します。 抽出材料は植物でSDS法でゲノムを抽出しました。目的は植物組織に感染している微生物をPCRで拾うことです。RT-PCRはしません。 Takara ex taqを使い、反応液量はこの説明書の「一般的なPCR反応液量」に書いてあるのと同じです。が、酵素だけ通常の2倍入れています（不経済なことは承知なんですが過去の経験から酵素を増やした方が、検出率が上がることがわかりました。教官もあまりいい顔はしませんが。。）。totalは25μl、プライマーは0.2μM(final conc.)、templateは約125ngです。 吸着ロスというのもあるのですね。。。。私の場合はどうなんでしょうかね。 APさんご指摘のように、最初のPCRがあまりしっかりとしたバンドではなかったのでこちらの方が怪しいと考えるべきかもしれません。 すでに他の数種類のプライマーを使って、その微生物の存在自体は確認できており、いることは確かだと考えてます。それで、このプライマーを使ったときだけ、最初の一回目とアニーリング温度を変えた時にちょこっとだけしか拾うことが出来ないので原因は何か考えていました。 アニーリング温度、プライマー、サンプルDNA、反応液の組成、、この辺に何か原因があるのではないかと思っていますが、何かお知恵を拝借できませんか。

(無題) 削除/引用 No.2131-2 - 2010/02/23 (火) 19:41:47 - AP もう少し背景の情報を挙げた方が良いと思います。一口にPCRといってもゲノムからなのかRT-PCRなのか、材料の種類やスケール、サンプルの濃度とか。 思い当たることが特にないのに、保存後のサンプルでPCRがかからなくなったとき、サンプル核酸の保存器具への吸着ロスの可能性があります。ttp://www.kenkyuu.net/cgi-biotech3/biotechforum.cgi?mode=view;Code=2084 サンプル量が濃度が十分に大きければ問題になることは少ないですが。 また、質問のケースではPCRが最初はかかったといっても、なんだかぱりっとしていないようですので、そっちのほうがartifactという可能性もあるんじゃないでしょうか。

PCRの再現性 削除/引用 No.2131-1 - 2010/02/23 (火) 18:31:29 - Trap PCRの再現性についてご教授ください。 一回目のPCRでは、全試料において目的のサイズにうっすらとバンド（TEに溶かした抽出DNAの凍結融解は無し。論文掲載のアニーリング温度に+２℃して58℃）が出ました。スメアの下にうっすらと出ている感じです。そして再現性を取ろうと思い2回目、全く同じ条件（DNAだけは凍結融解してます。別のPCRに2回使ったので、この時点で3回目の凍結融解になります。）でやったのですが一切バンドが出ませんでした。原因は何なのでしょうか。 アニーリング温度56℃、60℃でも試してみたところ、56℃でバンドが出ず（こちらはまだ2回目のPCRはしてません。）、60℃でやったら全試料のうち、2サンプルだけバンドが出て（こちらもいくつかの非特異反応の中に何とか、、、という感じです）、ですがもう一度PCRしたら今度は全くバンドが出なくなりました。 とりあえず、アニーリング温度58℃、60℃において1回目と2回目では結果が一致しません。56度も含め、いずれのものも目的サイズより上のところに非特異増幅が見られます。 こういった場合、どこに焦点を当てて原因究明して行くべきでしょうか。反応液のコンディションをいじるべきか、抽出DNAになにか問題があるのか（物理的な裁断が関係しているとか）？教えていただけないでしょうか。 もし仮に1回も目的サイズにバンドが出ていなかったら、検出できなかったと解釈できるのですが、一番最初にバンドが出てしまったので何とか検出し、再現性も取りたいと思っております。だいぶ土壺にはまりつつあります。 アドバイスよろしくお願いいたします。

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