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(無題) 削除/引用 No.212-6 - 2010/03/09 (火) 16:14:06 - なーぜ こんにちは 私もLR clonaseの反応について質問があるのですが、エントリーは１種類で、5xバッファー付きのLR Clonaseを使っています。 new power generationのプロトコールではエントリーの量を結構薄くして使っているのですね。やはり濃かったら良くないのですか？ちなみにプレープしたものはどれぐらいの濃度ですか？ 私はentry vectorとdestination vectorと１：１で、TOPO10に形質転換しています。 いままで生えてきたコロニーの数は１０個前後で、多くはないのですが、ものはちゃんととれていいとしていましたが、今DH５αで同じように形質転換をしたとこ、たくさんのコロニーが生えてきたのですが、PCRでまったく増えませんでした。 destination vectorのほうで、LR clonaseの反応で、GWのカセットだけがぬけてcddで死ぬことなく選抜されてきたのかなと思ったのですが、ほかにどうことが考えられるのでしょうか？ あと古くなったLR Clonaseはやはり効率悪いのでしょうか？ どうかお教え下さい。よろしくお願いいたします。

ありがとうございます 削除/引用 No.212-5 - 2009/03/23 (月) 10:03:24 - じゃーこ みなさま、ご返答ありがとうございます。 大腸菌の変更については相談してみようと思います。確かに、以前別な（Gatewayでない）クローニングで大腸菌をかえたらあっさりとれたということがありました。 インサートの毒性については多分大丈夫と思います。でもその点については全く考えていませんでした。今後注意していきたいと思います。 とりあえずエントリークローンをリクローニングして、再ミニプレップしています。メーカーのポジコンエントリークローンではうまくいっているので、精製がよくないのかもと言われ・・・。 new power generationさんと同じようなことを研究室のほかのメンバーにも言われました。試行錯誤して苦しんでいるうちに、なんだかわからないけどうまくいくようになるよと。えぇ〜という気持ちもありましたが、そういうものなんですね、きっと。複数の方がそういう経験ということは。 何とか前向きにやってみます！ありがとうございました！

(無題) 削除/引用 No.212-4 - 2009/03/20 (金) 00:06:25 - new power generation multisite gatewayを使われているのだと思います。 まず前提条件として、LR ClonaseIIと書かれていますがLR ClonaseII plusの間違いでよろしいですよね？ 複数断片のクローニングにはLR ClonaseIIは使えません。 私も使い始めはプロトコール通りにやっているつもりが全く上手くいきませんでした。同僚の方にコツを教えてもらってからは、濃度を測定することなしに極めて順調にworkしています。せいぜい泳動してentry cloneの濃度を何となく合わせることもある程度です。 その方が言うには、gatewayの反応は「１か０か」で、コロニーが多く出てきた時はほぼ100%正しくクローニングされているのですが、数個しか出てこないようなときは中途半端にクローニングされていることが多いようです。 通常私が行っているプロトコールですが、非常に単純です。 プラスミドは、1.5ml cultureをキットを使って調整することが多いのですが、entry cloneは通常のアルカリSDSで十分です。最後に100μlに溶いています。 半量の系でやっていて、destination vectorはプレップしたものを1μl加え、entry cloneはプレップしたものをさらにTEで1/10希釈したものをそれぞれ1μl加えます。 LRII+を1μl加えて25℃で反応・ProK処理後、市販のDH5aを25μl加え、形質転換しています。 時間は結構適当で、よく8h位でトラフォメしていますが普通に数10個位は生えてきます。 一度できるようになると、それまで何が悪かったのかさっぱりわからないくらいうまく行くようになると思います。 がんばってください。

(無題) 削除/引用 No.212-3 - 2009/03/19 (木) 19:30:50 - heimlich あんまり関係ないかもしれないですが、entry vectorとdestination vectorは、原理的には１対１がいいと思います。あと、反応に使う量は、20〜50fmolが推奨されていたと思うのですが。 自分がやった時には、それで問題はなかったです。 ちなみに、インサートの遺伝子産物は、大腸菌毒性とかはないのでしょうか？ entry vectorには、インサートをドライブするプロモーターが入ってないやつもありますので、それでentry vectorの入った大腸菌はとれているということはないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.212-2 - 2009/03/19 (木) 18:26:52 - ~ 根本的な解決策にはなっていないかもしれませんが大腸菌を変えるとか。 うちのラボではTOP10を使って、全く問題なくworkしてます。

インビトロジェン Gateway LR反応がうまくいかない 削除/引用 No.212-1 - 2009/03/19 (木) 14:46:09 - じゃーこ いつもこちらのサイトにはお世話になっております。 最近インビトロジェンのGatewayを使った組み替えを始めたのですが、LR反応後に大腸菌に導入後のコロニーが非常に少なく、かつ正しくない組み替えのものばかりとれてくるので困っています。 具体的にはBP反応で3種類のエントリークローンをつくり（ここではコロニーもたくさん出て、ミニプレップ後制限酵素でチェック、さらにシークエンスも確認しています）、その後LR反応を行ったのですが、コロニーが数個しか出ない上に、正しくない組み替えのクローンばかりなので困っています。 3種類のエントリーベクターを10 fmolずつ、デスティネーションベクターを20 fmol、LR ClonaseIIを2 ul、TEで10 ulにあわせて、室温で20時間おき、proK処理後、Mach1-T1 100 ulに入れています。 On iceで30分、heat shock後、SOC 500 ulを加えて1時間37Cでインキュベート後プレートに全量まいています。 キット付属のエントリーベクターでは、同じ系で70個程度のコロニーが得られています。 かなり煮詰まってしまって困っています。どなたかお気付きの点、コツなどありましたら、教えてください。 どうかよろしくお願いいたします。

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