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(無題) 削除/引用 No.2115-4 - 2010/02/23 (火) 12:22:09 - AP 増幅率が最初低くて、あとで急にあがるということですね。 実際にであったことはないですが、想像してみると ・逆転写後に鋳型RNAを除去（RNase H処理など）していない、あるいは不十分。相補なRNAが鋳型DNAに対してアニールすることで、増幅が干渉される。これは鋳型DNA(PCR産物）の量が少ないPCR初期で影響が大きい。（qRT-PCRのインストラクションでそういうこと書いているものもあると思います）。 ・ホットスタート酵素を使っていて、PCR初期の酵素の活性化が十分でない。

(無題) 削除/引用 No.2115-3 - 2010/02/19 (金) 20:37:28 - ぽー リアルタイムPCRではないですが、 以前ある遺伝子の一部をPCRで増幅し、電気泳動でシングルバンドだということを確認した後にSequenceで配列を確認してみると、実際にはpseudogeneらしきものが一緒に増えてしまっていたということを経験したことがあります。 BLASTで確認すると長さが3bpくらいしか違わないものだったので、バンドはシングルにしか見えなかったようです。 時間があれば２段階になってしまった時のサンプルをSequenceされてみてはどうでしょうか？ それで単一のものしか出てこなければPrimerは問題ないといえますから

(無題) 削除/引用 No.2115-2 - 2010/02/19 (金) 18:36:08 - ザンギ bio-radの装置や試薬は全く経験がありませんが、 酵素はホットスタートタイプでしょうか？ 2段階増幅（？）というのは、1段目でベースラインに傾きが着くようなイメージ でしょうか？ 共にメルティングカーブがシングルピークとのことですが、同じ形ですか？ ピークの裾野が広がったりしてないでしょうか。 バンディングしないような非特異的なDNA増幅でも2本鎖DNAならSYBRは光ってし まいますね。

増幅曲線が二段階になる不思議 削除/引用 No.2115-1 - 2010/02/19 (金) 02:31:50 - real time PCR初心者 最近リアルタイムPCRを扱いだしたものです。 使用機器はBioradのPTC-200、SYBRGreenを使用しております。 細胞はマウス腹腔マクロファージをLPS刺激し、そこから得られたRNAをRTし、qPCRを行っています。 検出遺伝子はTNFαでごくごく一般的な炎症関連遺伝子でprimerも半定量PCRを行うことでシングルバンドであることを確認しております。（primerダイマーも見えません。） そこで、このprimerを用いてqPCRを行い、その増幅曲線を見たところ、二段階に増幅してしまう事があり、そのデータの信用性への信頼が失われてしまう場合が時々あります。 不思議なのは、このPCR反応産物をアガロースゲル電気泳動してもシングルバンドであることです。 qPCRのメルティングカーブも一カ所でのみピークが見られますし。 しかも全く同じサンプルを同じようにqPCRを行っても二段階増幅される場合もあれば1段階でキレイに増幅される場合もあります。非常に困っています。 二段階増幅した結果はunreasonableであり、1段階増幅された結果はLPS依存的にTNFαがしっかり産生されていることが確認されております。 そのため二段階増幅したqPCR結果は信用できないのだろうと考えています。 が、原因が分からず困っております。 もし、みなさまの中で同じようなご経験があり、その解決方法をご存知であればご教示頂けないでしょうか？宜しくお願いいたします。

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