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(無題) 削除/引用 No.2113-7 - 2010/02/22 (月) 11:34:58 - ブロット qqさま ありがとうございます。 >やってみればすぐに分かりますが、NCをMeOHに漬けると溶解してしまいます そうなんですね。ありがとうございます。 私が調べた限りでは、乾燥したNC膜にタンパク溶液を滴下する場合と、Tween20 などdetergentなしのTBSであらかじめNC膜を平衡化して、そこにタンパク溶液を滴下するとありました。 qqさまはどちらで行われておりますでしょうか？ 個人的に思うのは、乾燥したNC膜にタンパク溶液を滴下すると、毛細管現象が起きやすくなり、望んだドットにならず広がってしまうのではとの懸念があります。 しかし、どちらかというと乾燥したNC膜でOKとする記述を多く見かけます。 そういったものは吸着させる溶液量が1 ulとか微量のためだからなのかもしれません。 私は上限100 ulほどの量を吸着させたいと考えております。 どうか、こういった場合、NCを平衡化した方がよいのか、または100 ulもの多量の溶液をドットにする際に気を付ける点や上手くいくためのポイントなど教えていただけますと幸いですm(__)m

(無題) 削除/引用 No.2113-6 - 2010/02/22 (月) 09:07:58 - qq >PVDF膜をMeOHで平衡化するように、NC膜でも同じように平衡化するのでしょうか？ やってみればすぐに分かりますが、NCをMeOHに漬けると溶解してしまいます。

(無題) 削除/引用 No.2113-5 - 2010/02/20 (土) 19:15:30 - ブロット qqさま 早速のアドバイスをありがとうございますm(__)m >「希釈し、速やかに膜にスポット」するほうがよろしいです。 了解しました。大変分かりやすいご説明ありがとうございます。 >ニトロセルロースにタンパクを吸着する場合は、10mM程度のMgCl2か、0.5M程度のNaClが効果的な場合が多いと思います。 グリセロールは必要ないとのこと、確認できて安心しました。 MgClとNaClに関しても初めて聞いたことばかりで大変参考になりますm(__)m >直ぐに吸引するのではなく、10分程度放置する方が良いかもしれませんが、直ぐに吸引しても吸着するだろうとも思います。 そうなんですね。実はNC膜を扱うのは初めてでして、その膜の扱いにも不安があります。 PVDF膜をMeOHで平衡化するように、NC膜でも同じように平衡化するのでしょうか？ 現在、私はPBSTでNC膜を馴染ませたものをDot plot用の器具に固定しております。 あるいはそんなことは必要なく、まっさらで乾燥しているNC膜に直接サンプルを滴下してもよいのでしょうか？qqさまのNC膜の扱い方についてお話いただけますと幸いですm(__)m ＞一点ではなく、ウェルの形に均質に丸く吸着されることが理想的なのではないでしょうか？ もうしわけありません。私の説明が下手なために…ご指摘の通りですm(__)m

(無題) 削除/引用 No.2113-4 - 2010/02/20 (土) 14:41:12 - qq >1 % SDSの入ったサンプルバッファーで行っておりました。 >0.05 % 程度まで下げても十分リコンビナントタンパクは変性 >できるのでしょうか？ 保証はできませんが、一般的に変性たんぱく質は容易に再生しませんから、おそらく変性しています。ただし、希釈によって溶解度が低下し不溶化しやすくなっているでしょうから、「希釈し、速やかに膜にスポット」するほうがよろしいです。 >またsample buffer中にはグリセロールも入っております。こう >いったものはSDS-PAGEをするわけではありませんので、本当は >必要ないのでしょうか？？ きっと必要ありません。ニトロセルロースにタンパクを吸着する場合は、10mM程度のMgCl2か、0.5M程度のNaClが効果的な場合が多いと思います。 96wellのようなマニフォールドなら、 SDS化した1mg/ml程度のタンパクがあるとして、3-30ulをPBSで3.0mlに一気に希釈して（1-10ug/ml程度）、50ulずつ分注できるディスペンサで各ウェルに50ulずつ添加するので良いのではないでしょうか。直ぐに吸引するのではなく、10分程度放置する方が良いかもしれませんが、直ぐに吸引しても吸着するだろうとも思います。 ＞バキュームすることで膜に吸着させますが、どうも一点に吸着されず、 と、言っていますが、一点ではなく、ウェルの形に均質に丸く吸着されることが理想的なのではないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2113-3 - 2010/02/20 (土) 13:18:31 - ブロット qqさま 本当に、本当にアドバイスありがとうございますm(__)m ご意見いただいて、そうだったのか、と驚いております、ありがとうございますm(__)m リコンビナントタンパクを精製後、PBSにbuffer置換したものが手元にあります。 通常SDS-PAGEをやればよいのですが、抗体の培養上清が非常に多く、そのためのドットプロットの適応を考えております。 １つ、お伺いしてもよろしいでしょうか？ 1 % SDSの入ったサンプルバッファーで行っておりました。 0.05 % 程度まで下げても十分リコンビナントタンパクは変性できるのでしょうか？ またsample buffer中にはグリセロールも入っております。こういったものはSDS-PAGEをするわけではありませんので、本当は必要ないのでしょうか？？ もし、そうだとすれば、バキュームするwellに必要最低限何を加えてサンプルを流し込めばよいのでしょうか？ 例えば現在は 1. リコンビナントタンパク 2. SDS-sample buffer（SDS, グリセロール, Tris-HCl）+ 2-ME, +BPB ですが、 1. リコンビナントタンパク 2. final 0.05 % SDS + 2-ME, +BPB in 1 x PBS でもよろしいでしょうか？ qqさまのご意見をもう一度伺えるならお願いいたします。 本当に、ありがとうございましたm(__)m

(無題) 削除/引用 No.2113-2 - 2010/02/20 (土) 11:07:19 - qq >ここで疑問に思ったのは、リコンビナントタンパクをSDSサンプル >バッファーで希釈したものを小さなwellに入れ、バキュームするこ >とで膜に吸着させますが、どうも一点 PDVF（やおそらくNC膜も）へタンパクを吸着させる条件として考えると、１％SDSは、、、きっと無茶です。 SDSサンプルバッファーに溶解してあるタンパク試料なら。DWかPBSでSDS濃度0.05%程度に希釈し、速やかに膜にスポットします。もしくは、SDSでなく尿素で変性溶解して、20倍程度に希釈し速やかに、スポットします。

タンパクが上手に膜に乗りません 削除/引用 No.2113-1 - 2010/02/19 (金) 00:48:27 - ブロット みなさん教えてください。 現在、あるタンパクをwestern blotで検出できるようなマウスモノクロを作成しております。 まずハイブリドーマのスクリーニングをELISAで行い、陽性を示したものにつき、続いてwesternで五月雨式にそれらが使えるかを確認しようとしています。 リコンビナントをSDS-PAGEし、それをIBすればよいのですが、ELISAで陽性を示したクローンが半端なく多く、そのためリコンビナントをニトロセルロース膜にドットプロットし、そこにハイブリドーマ上清を乗せてスクリーニングしようと考えています。 ここで疑問に思ったのは、リコンビナントタンパクをSDSサンプルバッファーで希釈したものを小さなwellに入れ、バキュームすることで膜に吸着させますが、どうも一点に吸着されず、横にはみ出てしまいます。（これはサンプルバッファーにBPBが入っているため、吸着した場所が可視化できるから分かります） みなさんはdot plotで気をつける事はなにがありますか？ 私はニトロセルロース膜をPBS-Tで湿らせたところにサンプルを落として吸引させています。 またニトロセルロース膜ではなくPVDF膜に変えて吸引しても一点に定まらず、スポットが横にはみ出てしまいます。 膜はもの凄くしっかり固定しています。 なかなか難しいんでしょうか？ それからサンプルをapplyする時は48 wellある穴のうち16 wellくらいにサンプルを落としていますが、残りのwellはからのままで吸引させていますが、これも大丈夫でしょうか？ 全部のwellを何かしらのサンプルで埋めた方がよいのかとも思いますが… どうか経験者のご意見がいただけますと幸いですm(__)m

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