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(無題) 削除/引用 No.211-4 - 2009/03/19 (木) 21:33:03 - シュン 化学発光の検出感度を上げるのも手です。少ないタンパク量でも例えば、Pierce super signal west picoを使っているならwest femtoに変えるだけでも10倍以上感度が上がります。

(無題) 削除/引用 No.211-3 - 2009/03/19 (木) 15:35:26 - IRES サンプルのタンパク質濃度が低いのでしょうか？それとも絶対量が少ないのでしょうか？前者でしたらサンプルの濃縮はできませんか？ 2ug/laneでのWBが出来るかどうかについては検出したいものによりますね。 今採材できるもので予備実験をすることで可能かどうか類推できませんか？

(無題) 削除/引用 No.211-2 - 2009/03/19 (木) 13:13:55 - C 単に、細胞数に対してlysis bufferの液量が多すぎて蛋白質濃度が薄くなりすぎているのだと思います。SDSなどで可溶化していないサンプルならば、TCAなどで蛋白質をいったん沈殿させてからアセトンで洗って、その沈殿をあらためて適切な量のSDS-sample bufferに溶かすというきわめて古典的な方法があります。ただ、酸性でも可溶な強塩基性蛋白質の一部がこの過程でロスするおそれはあります。これ以外にも蛋白質の沈殿させるには大過剰の冷エタノールや冷アセトンのような有機溶媒を加えて−８０Cで一晩置くような方法も使えますが塩が沈殿するかもしれませんし、こうした溶媒に沈殿しにくい蛋白質のロスが起きる可能性は否定できません。 冒頭に書いたようなことがないとすれば、lysis buffer の組成が不適切で細胞がちゃんと壊れていないか、あるいは蛋白質がうまく抽出できていないという可能性もありますので見直してみてください。

ウェスタンにおけるサンプルの蛋白質含有量について 削除/引用 No.211-1 - 2009/03/19 (木) 11:17:37 - ｋｋ 細胞培養を行っていて、得られたサンプルをもとにウェスタンブロッティングを行おうと思っているのですが、サンプルの蛋白含有量が少なくて困っております。 ラットから得られたサンプルでウェスタンを行ったときには１アプライ１５μgの蛋白質を流していましたが。今回のサンプルでは1〜2マイクログラムぐらいしか流すことが出来ません。 サンプルの採材は再びやる予定はないので何とか今あるサンプルで流したいのですが微量蛋白質でもウェスタンを行うことは可能でしょうか？体験談・文献などありましたら教えてください。 よろしくお願いします。

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