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(無題) 削除/引用 No.2108-20 - 2010/10/02 (土) 02:35:02 - 2ndAB 些細な疑問ですがもし良かったら便乗させてください。 現在、ヒト骨髄腫細胞株のウエスタン解析（シグナル伝達、リン酸化やアポトーシス関連）を行っています。 一次抗体には主にＣＳＴ社（ラビットpoly)の抗体を使い、二次抗体にはＧＥ社のDonky anti Rabitt IgG(H+L)を使用しています。 この二次抗体を選んだ理由は特にありません。昔から慣習的に研究室にありました。 ＣＳＴ社のデーターシートにあるFigでは（細胞種や実験条件は私と違いますが）ノンスペのないきれいな写真が出ているのに対して、私はノンスペが多くなってしまいます。 ふと思ったのですが、骨髄腫細胞株のように免疫グロブリンを産生するような細胞の場合には吸収済み二次抗体を使用するべきなのでしょうか? （例：ジャクソン社　111-035-144,ヒト・マウス等吸収済み） また、他のトピックで「ＣＳＴ社の一次抗体にはＣＳＴ社の二次抗体を使用したほうが良い」という意見もあり、機会があれば変更しようかと迷っています。 もし良かったら教えてください。

(無題) 削除/引用 No.2108-18 - 2010/03/03 (水) 07:06:18 - 通りすがり ↓ 二次抗体サンプルをもらったのは、Cell singalからです。 情報不足で申し訳ありません。

(無題) 削除/引用 No.2108-17 - 2010/03/03 (水) 07:05:15 - 通りすがり 以前、cell signalの一次抗体とGEの二次抗体を使っていて 問題が発生したし時、二次抗体のサンプルをもらいました。 実験条件は同じで、二次抗体を変えただけで 問題は解決できました。 相性ってあると思いました。

(無題) 削除/引用 No.2108-16 - 2010/02/26 (金) 20:56:39 - c ２次抗体-HRPはいつもmouse Abも　rabbit AbもKPL社(フナコシで取り扱い）のを使ってます。希釈率は1/5000〜1/10000位でやってますが、質的にはまったく問題なく使えております。また量が多いのに、価格が数千円と他社よりも安いので重宝してます。同様に、安いのに使えるという理由でCAY社（フナコシで取り扱い）のものも時々使います。

SC社の二次抗体（訂正） 削除/引用 No.2108-15 - 2010/02/26 (金) 17:45:46 - 超初心者 >最初からSC社の二次抗体ははじかれていますが、現在出向しているラボではSC社の二次抗体を使っています。100,000倍希釈で普通に検出できます。 すみません、10,000倍希釈の誤りです。

SC社の二次抗体 削除/引用 No.2108-14 - 2010/02/26 (金) 17:43:42 - 超初心者 最初からSC社の二次抗体ははじかれていますが、現在出向しているラボではSC社の二次抗体を使っています。100,000倍希釈で普通に検出できます。 決してSC社の関係者ではありません。 私も一次抗体はcell signalingを優先しています。

(無題) 削除/引用 No.2108-13 - 2010/02/23 (火) 12:58:45 - tm >[Re:11] ともさんは書きました : > たとえば、私はJacksonのを使っていますが、だいたい1:100,000希釈くらいで使用しています（ECL Plusf発色）（メーカーのsuggestionは1:10,000 - 1:200,000くらい）。元濃度はどこのメーカーもだいたい1 mg/ml前後とおもいますが、Zymedの推奨使用濃度はHRPラベルで1:1,000 - 1:2,000とあり、かなり高濃度だなぁと思ってしまいます。tmさんは実際にはZymed二次抗体どれくらいの希釈で使ってますか？ 実験ごとに至適化はしますが，1/20,000〜1/200,000ぐらいです．大体は1/50,000か1/100,000でうまくいっていました．こちらもECL plusかImmobilonを使っています．検出系の感度が高い分，希釈倍率も高くしていく必要がありますね．手元の添付資料ではケミルミで1/5,000〜1/20,000となっているので，より高感度なECL plusなどで希釈倍率が高くなるのもリーズナブルだと思っているのですが． > もしメーカーごとに最適希釈濃度が大幅に違うのなら、それぞれの最適条件で得られるsignalあるいはsignal/noiseも結構違うのかなぁと考えてしまいます。 > > それぞれのラボでワークしている二次抗体があると、違うメーカーのものを比較する機会はなかなかないのですが、実際のところどうなんでしょうか？ メーカーごとでちゃんと比較したことはないですね．ラボに元々あったヤツを使うとか，なくなったからじゃぁ好きなメーカーの買おうとか，そう言うレベルです．それで外れたことがないので，二次抗体に関してはどのメーカーでも大差ないかなぁと言う印象を持っています．ただ，希釈倍率は至適化すればS/N比がよくなることもあるので，この点は毎回試します． トピ主さんの場合は感度が悪いのでと言うことですから，他の方も書かれていますが条件を見直したり一次抗体を変えて検討するほうがいいかと思います．自分ならそうします．でももし二次抗体のメーカーを変えて検討したのなら，是非ここで結果を教えて下さいね．

(無題) 削除/引用 No.2108-12 - 2010/02/23 (火) 10:54:12 - dksaomnb みなさん詳しい回答ありがとうございました。参考にさせて頂きます。

(無題) 削除/引用 No.2108-11 - 2010/02/19 (金) 05:38:23 - とも >[Re:7] tmさんは書きました : > westernで使う二次抗体ってあんまり当たり外れがないように思いますが，自分はZymedのものをよく使っていました．特にZyMax gradeのものを． たしかに、幅広く使われる二次抗体がタコだとメーカーにバッシングがくるでしょうから、売られている抗体はそれなりにワークするのだと思います。 それでも二次抗体がメーカーによって違うまかなぁ、と思ったりすることもあります。その理由の一つに、実際の使用濃度（あるいは推奨使用濃度）がメーカーによってかなり違うようだということがあります。たとえば、私はJacksonのを使っていますが、だいたい1:100,000希釈くらいで使用しています（ECL Plusf発色）（メーカーのsuggestionは1:10,000 - 1:200,000くらい）。元濃度はどこのメーカーもだいたい1 mg/ml前後とおもいますが、Zymedの推奨使用濃度はHRPラベルで1:1,000 - 1:2,000とあり、かなり高濃度だなぁと思ってしまいます。tmさんは実際にはZymed二次抗体どれくらいの希釈で使ってますか？ もしメーカーごとに最適希釈濃度が大幅に違うのなら、それぞれの最適条件で得られるsignalあるいはsignal/noiseも結構違うのかなぁと考えてしまいます。 それぞれのラボでワークしている二次抗体があると、違うメーカーのものを比較する機会はなかなかないのですが、実際のところどうなんでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2108-10 - 2010/02/18 (木) 15:06:15 - USB dksaomnb様 2次抗体に関してはたいてい大丈夫だと思います。私はJacksonを使用しています。 WBの感度が悪いとのことですが、二次抗体を原因とされた理由は何かあるのでしょうか？個人的な感想ですが、極端に古いことや、保存状態が悪いことなどがなければ二次抗体がさほど問題になることはないように思います。 目的のタンパクが十分存在してるのにWBの感度が悪いのであれば、私は一次抗体を選び直します。 一次抗体は論文を検索し、WBのデータがFigとして載っているものを購入するようにしております。 また、個人的にはBD、chemiconなどは信頼しています。SC社は抗体が豊富でマイナーなタンパク質に対する抗体もそろえておられますが、そういったものは外れが多い印象です。（メジャーなタンパク質に対する抗体は問題ないように思います） 他に感度を上げる方法としては、試薬を変更する（ECLからECL+やAdvanced ECL）、や一次抗体の反応時間を延ばす、などを考えます。 どちらもバックを上げないように注意が必要です。

(無題) 削除/引用 No.2108-9 - 2010/02/18 (木) 14:54:25 - in situ 二次抗体のメーカーを変える前に検討すべき点がいくつもある気がします。 １．ロードしているタンパク質量は十分なのか ２．トランスファーの条件（メタノール入れる入れない。時間。ゲルにタンパク質の残存はないかをチェック） ３．ブロッキング（過剰にブロッキングしていないか） ４．１次抗体の濃度、反応時間、反応温度 ５．検出法（発色か発光かなど） これらをしっかり検討したうえで、内部コントロール（βアクチンとか）のバンドも検出しづらいというのであれば二次抗体の問題を疑いますが、今まで１〜５でほとんど問題が解決しています。 以上の上で、どうしても検出しづらいタンパク質があるというのであれば、二次抗体を変えるよりもVECTOR社から出ているABCキットなどの増感法などを用いることをお勧めします。

WB感度について 削除/引用 No.2108-8 - 2010/02/18 (木) 14:24:31 - dksaomnb みなさん親切に回答してくださってありがとうございます。 実は、今使っている2次抗体を変えようかと考えたのは、WBの感度が予想していたよりも悪かったためです。抗体を使った実験は抗体の良し悪しが大きなポイントとなるみたいなので、二次抗体の濃度を振ったりする以外に、抗体自体を変えたらどうかと考え、メーカーについて調べていたところです。 現時点でWBをしていて気になっているのはこの感度の悪さなので、抗体に関すること以外にも、何か感度を上げるための助言等あればお願いしたいです。

(無題) 削除/引用 No.2108-7 - 2010/02/18 (木) 11:00:54 - tm westernで使う二次抗体ってあんまり当たり外れがないように思いますが，自分はZymedのものをよく使っていました．特にZyMax gradeのものを． 今使っていて特に問題なくworkしているのなら，あえて変える必要はないかと思いますよ．

(無題) 削除/引用 No.2108-6 - 2010/02/18 (木) 10:25:25 - window うちはWBの二次抗体にJacksonを使用しております。 問題はありません。 でも私も比較をしたわけではないので、違いがあるのかどうか分らないです。 ただ、比較してどこがよかったという話を聞きたことがないということは、大差ないということなのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2108-5 - 2010/02/18 (木) 09:55:01 - ats 「なんとなく」臨床検査用の抗体も作製している・価格も普通という理由でDAKO社製を使っています。DAKO社製は二次抗体しか使ったことはないですが、希釈率(ECL-plus併用で1万倍以上）や4度保存で問題になったことはないです。

(無題) 削除/引用 No.2108-4 - 2010/02/17 (水) 22:19:40 - toyo WB用の1次抗体ならたしかにCSTが第一選択という実感がありますが、 2次抗体はラボ内で共通(GE)のものをずっと使っているので、 2次抗体の選択基準が私には良くわかりません。 横レスですが、ご存じの方いらしたら教えていただけると嬉しいです。

(無題) 削除/引用 No.2108-3 - 2010/02/17 (水) 22:19:30 - 抗体 一部例外はあるかもしれないけど、全体として最近は10年くらい前と比べるとハズレはかなり少なくなってきたなと感じています。去年〜今年にかけていろいろな抗体を買ったけどハズレは1／5くらいの確率だったです。ただIPも出来るのは少ないです。

(無題) 削除/引用 No.2108-2 - 2010/02/17 (水) 22:03:15 - とと CELL SIGNALINGのものを使用しています。 Jackson社、Vector laboratories、R&D、DAKOよりもWESTERN関連に強いメーカーという印象があります。

二次抗体メーカーについて 削除/引用 No.2108-1 - 2010/02/17 (水) 21:02:59 - dksaomnb つい先日抗体を用いた実験を始めた新参者なのですが、WBの二次抗体(HRP標識抗ウサギ二次抗体)について、メーカーがたくさんあり、どのメーカーのものを購入すればよいか迷っています。過去ログを参照させて頂いたところ、SC社はあまり良くない・・・というのはわかりました。今購入を考えているメーカーの候補は、Jackson社、Vector laboratories、R&D、DAKOの4社です。 この4社はGoogle schoarなどで検索し、そのメーカーの抗体を用いている論文数などを参考に絞りました。これも過去ログに選び方についてそのように書いていらっしゃる方がいましたので参考にさせて頂きました。 ほかなにか良いメーカーがありましたらぜひ助言お願いします。 また、今用いている二次抗体はPromega社のものなんですが、このメーカーの評判も詳しい方いましたら教えて頂きたいです。

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